הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

ויזואליזציה של דינמיקת סידן חשובה להבין את תפקידו של הסידן בפיזיולוגיה תא. כדי לבחון את דינמיקת סידן, Ca ^{2 +} דדי ניאון סינטטיים הפכו פופולריים. כאן אנו מדגימים TED (= טעינת צבע מושרה ממוקד-esterase), כדי לשפר את שיטת השחרור של Ca ^{2 +} צבעי חיווי בלומן ER של תאים מסוגים שונים. נכון להיום, טד היה בשימוש בשורות תאים, תאי גלייה ונוירונים במבחנה. בסיסים על TED יעיל, רקומביננטי מיקוד של פעילות carboxylesterase גבוהה ללום ER באמצעות וקטור מבנים שCarboxylesterases Express (CES). וקטורי TED האחרונים מכילים רכיב ליבה של CES2 התמזג חלבון פלואורסצנטי אדום, ובכך מאפשרים הדמיה בשני צבעים בו זמנית. הדינמיקה של סידן חופשי בחדר המיון הם צילמו בצבע אחד, ואילו את מבנה חדר המיון המקביל מופיע באדום. בתחילתו של ההליך, תאי transduced עם lentivirus. בהמשך, התאים הנגועיםזורעים מחדש על coverslips סוף סוף יאפשר הדמיה תא חי. לאחר מכן, תאי חיים מודגרת עם אסתר acetoxymethyl (AM-אסתר) טופס הזיקה נמוכה Ca ^{2 +} מחוונים, למשל Fluo5N-AM, מאג-Fluo4-AM, או מאג-Fura2-AM. פעילות ולין בדבק ER את צד רשתות הידרופובי מהטופס הנני Ca ^{2 +} חיווי ומורכב ⁺ צבע / Ca ² ניאון הידרופילי נוצר ונלכדה בלומן ER. לאחר טעינת צבע, התאים מנותחים במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוך. תאי perfused ברציפות עם פתרונות כמו צלצול ואת דינמיקת סיד ER הן ישירות דמיינו ידי הדמיה זמן לשגות. שחרור סידן מחדר המיון מזוהה על ידי ירידה בעוצמת הקרינה באזורים של עניין, בעוד שהמילוי של חנות סיד ER מייצר עלייה בעוצמת הקרינה. לבסוף, השינוי בעוצמת ניאון לאורך הזמן נקבע על ידי חישוב ΔF / F _0.