Denne forskning blev støttet af tilskud GM046406 (DB) og af National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). RSM anerkender midler fra NSF Graduate Research Fellowship. MNM understøttes af en Lewis-Sigler Fellowship. Vi vil gerne anerkende medlemmerne af Botstein laboratorium for nyttige diskussioner og den tidligere medlemmer Allegra Petti og Nikolai Slavov for deres bidrag til den metaboliske cyklus-projektet. Vi takker Daniel Zenklusen og Robert Singer for at få os i gang med FISH-metoden.

Figur 1 og 2 er skematisk af de fisk eksperimentelle procedurer og billedanalyse pipeline anvendt til kvantificering FISH billeder. 1.. Løsninger til at forberede * De løsninger nedenfor er til brug med Singer sonder. Hvis du bruger Stellaris sonder, erstatte &quot;40% formamid&quot; med &quot;10% formamid&quot; i både hybridiseringsbuffer og vaskebuffer. Yderligere ændringer til hybridiseringsbuffer ved brug Stellaris sonder er (1) tilsættes 1 g dextransulfat og (2) ikke omfatter 10 mg ssDNA. Puffer B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Spheroplasting Buffer 890 ul puffer B 100 pi VRC 10 pi 25.000 U / ml Lyticase 2 pi β-mercaptoethanol &lt;strong&gt; hybridiseringsbuffer (10 ml, slutvolumen) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 pi 200 mM VRC lager 40 pi 50 mg / ml BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% Formamid * Nuklease Free Water (til 10 ml slutvolumen) 1 g dextransulfat * * Hybridiseringsbuffer kan holdes i 0,5 ml alikvoter ved -20 ° C for bekvemmelighed. Vaskebuffer (50 ml, slutvolumen) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% Formamid * Nuklease Free Water (til 50 ml slutvolumen) Mærkning Buffer 1,06 g Natriumcarbonat 100 ml DEPC Water pH 9 2.. Probe-mærkning (Singer prober Only) Vi får disse prober ved in-house syntese ved anvendelse af en ABI oligonukleotidsyntese apparat. Typicallierede er 4-5 ~ 50 bp oligonukleotider syntetiseret som er homolog med genet af interesse, substituere amino-allyl thymidin flere thymidines afstand på mindst 8, fortrinsvis 10 + bp fra hinanden. På grund af deres følsomhed over for ozon, arbejder vi i en ozon-fri anlæg, når du bruger CY farvestoffer. <ol><li> Anskaf ~ 5 sonder og resuspender i 100 pi vand - kontrol fusioner NanoDrop. </li><li> Afhængigt af hvor mange prober / gen, kombinere alt 10 ug oligonukleotider / gen (fx hvis har 5 prober / gen, derefter ønsker 2 ug / sonden). </li><li> Brug QIAquick kolonner at rense prober ifølge QIAquick Nucleotide Removal Kit protokol. </li><li> Tilføj 10 volumener Buffer PN til den samlede mængde af kombinerede sonder og bland. </li><li> Påfør prøven QIAquick kolonne - hvis samlede volumen er større end 750 ul, spin ned to gange med halvdelen af ​​volumen i hver tur </li><li> Lad det stå i 1 min. </li><li> Centrifuger 1 min ved 6000 rpm. </li><li> Vask med 750 ul buffer PE. </li><li> Centrifuge1 min ved 6000 rpm. </li><li> Kassér gennemstrømning og re-spin kolonne i 1 minut ved 13.000 rpm for at tørre. </li><li> Placer QIAquick kolonne i ny mikrocentrifugerør og der elueres DNA med 50 pl H 2 O - Sørg H 2 O pH er inden for 7,0 og 8,5, og er placeret direkte på membranen. </li><li> Lad det stå i 1 min. </li><li> Centrifuger i 1 minut ved 13.000 rpm for at eluere DNA. </li><li> Lyofiliser DNA ved 45 ° C. </li><li> Resuspender pellet i 10 pi mærkning puffer og tilføje til rør af farvestof uden at røre farvestof. </li><li> Gentag med en anden 10 pi mærkning puffer. </li><li> Vortex og spin ned tube farvestof og DNA. </li><li> Dæk rør med aluminiumsfolie og holde mørke ved RT O / N til at mærke. </li><li> Gentag QIAquick Nucleotide Removal Kit protokol. Udføre med to forskelle: - Tilsæt 200 pi PN-puffer til prober og sætte mærkede prober gennem kolonnerne 2x. - Udføre 3 vaske med buffer PE for at vaske væk enhver Ikkefastgjorte farvestof før eluering. </li><li> After eluering opnå koncentration via NanoDrop. Mærkningen effektivitet er typisk ~ 0.25 pmol / ng enkeltstrenget DNA. </li></ol> 3.. Coverslip Forberedelse <ol><li> Sted dækglas på dias i Plasma-blære vakuumkammer ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (jo tættere på centrum, jo bedre). </li><li> Put vakuumkammer i mikroovn og sørg for at det er forseglet. </li><li> Tænd pumpen først tænd derefter vakuum kun én gang pumpen startes. </li><li> Tænd mikroovn og stoppe 5 sek efter plasma er synligt. </li><li> Sluk vakuum derefter pumpe. </li><li> Træk vakuumkammer og fjerne dækglas med en pincet (dem, der er faldet skal renses igen). </li><li> Sted dækglas renset opad i 12-brønds plader. </li></ol> 4.. Fiksering Procedure <ol><li> Grow gær til en OD600 på omkring 0,1-0,2 i minimale medier. 10 ml celler giver nok for ~ 10 separate hybridiseringer. </li><li> Tilføj 1/10 rumfang 37% formaldehyd direkte til vækstmedierne (10 ml kultur + 1 ml 37% formaldehyd) og lad det sidde i 45 minutter. </li><li> Vask 2x med 1 ml iskold puffer B i et mikrocentrifugerør (kan dreje ved 13.000 rpm i 1 min). </li><li> Tilsæt 1 ml spheroplasting buffer. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i 15 min. Tjek celler hvert par minutter under mikroskop, indtil de fleste celler er sorte (dvs. ikke fase-lys). </li><li> Vask 2x med iskold puffer B, spinning ved lav hastighed (~ 3.500 rpm). </li><li> Tilsæt 1 ml 70% EtOH, resuspenderes forsigtigt og lad natten over ved 4 ° C (kan opbevares på ubestemt tid ved -20 ° C). </li></ol> 5.. Hybridisering Fremgangsmåde <ol><li> Forbered hybridisering løsning: til 100 ul hybridiseringsbufferen 1-3 pi sonde, så vortex og centrifugeres tilføje. Singer sonder bruger 8-10 ng alt pr sonde sæt (dvs. pr-gen). Vi har afbildet op til 3 gener samtidigt med 3 DIFderledes mærket probe sæt. </li></ol> Vær sikker på at opvarme hybridisering opløsningen til stuetemperatur, før du åbner den. For Stellaris sonder, anbefales det at starte 4 separate hybridiseringsreaktioner ved tilsætning af 1 pi hver af 01:10, 01:20, 01:50 og 1:100 arbejdsdage fortyndinger af prober at se, hvilke er optimal. Working fortyndinger af Stellaris sonder er udarbejdet i hybridiseringspuffer. <ol start="2"><li> Centrifuge (for alle efterfølgende trin, 3.500 rpm, 5 min) de faste celler (fx 200 ul) opsuges væk ethanol. </li><li> Forsigtigt resuspender i 1 ml vaskebuffer, som indeholder den samme procentdel formamid som hybridiseringsbufferen. Lad det stå i 2-5 min. </li><li> Centrifuger prøven og aspirat vaskebuffer, derefter tilføje hybridiseringsopløsning. Inkuber i mørke med forsigtig rystning, O / N ved 37 ° C. </li></ol> Bemærk: Den følgende procedure er for at anvende / billeddannelse celler på dækglas. For wforaskning / billeddannelse celler i 96-brønds plader, herunder alternative reaktiv ilt arter scavenger løsning se <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Den næste dag, eller i forvejen, ren (se procedure) og behandles dækglas med 150 gl 0,01% poly-L-lysin i 5 min. Aspirere, lad tørre, vask 3x med dH2O og lad tørre. </li><li> I morgen, tilsættes 1 ml vaskebuffer til prøven, forsigtigt resuspenderes, centrifuge og aspirere, og derefter resuspenderes i en anden 1 ml vaskebuffer og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. </li><li> Vask med 2X SSC + 0,1% Triton X-100 ved RT 15 min på rysteapparat. </li><li> Tag monteringsmedium ud af fryseren, så det kan komme op til RT før montering. </li><li> Vask med 1X SSC ved stuetemperatur 15 minutter på rysteapparat. </li><li> Fortynd DAPI i PBS (0,1 ug / ml endelig) og resuspender celler i 150 pi. </li><li> Placer opløsning på renset / poly-lys-treated dækglas i 12-brønds plade, mindst 30 min uforstyrret. </li><li> Fjern løsning (du kan placere den på et ekstra dækglas som backup) og vask 3 x med 1 ml 1X PBS. </li><li> Placer 3 pi Forlæng Gold montering medium på en slæde (Invitrogen P36934). Gør dette et ad gangen, hvis du har flere dækglas for at undgå udtørring af montering medium. </li><li> Tilføj ~ 0,5 ml ethanol til dækglasset i 12-brønds plade, fjern dækslet slip og lufttørre, mens du holder med en pincet. </li><li> Placer dækglassene celle nedad på montering medium og lad hærde flere timer eller O / N i mørke. </li><li> Forsegle kanterne med neglelak og fortsæt til billeddannelse. </li></ol> 6.. Imaging Celler med Olympus IX-81 omvendt mikroskop Oversigt <ol><li> For billedet købet vi udnytter Slidebook (intelligent-imaging.com) software og en 100X, 1,45 NA, TIRFM olie mål. For seriel GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 og Cy5 imaging: Chroma filter sæt (se reagenser). </li><li> Brug DAPI-filterat finde og fokusere celler. </li><li> Indstil denne som referencepunkt. </li><li> Tag en z-stak af billeder rundt referencepunktet hvis den samlede afstand er 5 uM med 0,2 uM størrelse (25 fly). Gentag for hver farve kanal (dvs. hver probe sæt). </li><li> Eksportere en 16-bit TIFF for billedanalyse. </li></ol> 7.. Image Analysis Oversigt (Singer Probes) Nedenfor giver vi en oversigt over beregningsmæssige metoder, vi bruger til at analysere FISH billeder i Matlab. De relevante MATLAB anvendte funktioner parentes til højre. De algoritmer og tærskler er i øjeblikket indstillet til data fra Singer stil sonder. Brug Stellaris stil sonder vil kræve en vis tilpasning, især til den endelige filtrering trin (7,8). Celleidentifikation 15 <ol><li> Separate celler fra baggrunden ved hjælp af en global tærskelværdi på DAPI billeder 16 [graythresh]. </li><li> Identificer kerner bruger udvidet maxima funktionen [imextendedmax]. </li><li> Segment celler med kerner som frø for et skelsættende algoritme [vandskel]. </li></ol> Find pletter i hver fluorescens kanal <ol start="4"><li> Udfør Tophat transformation at normalisere baggrund og forbedre signal støjforhold [bwmorph]. </li><li> Find maksima at identificere i fokus lag (i z-planet) for hver plet [imregionalmax]. </li><li> Filtrere potentielle pletter ved hjælp af en lineær tilpasning model til en radial graduering. </li></ol> Mål spot intensitet og filter single vs multiple probesignaler <ol start="7"><li> Monter en 2D gaussisk profil til stedet i tidligere identificerede i fokus lag og skøn intensitet 17.. </li><li> Bortfiltrere svage punkter ved hjælp af en tærskel (baseret på histogram). For Singer typen sonder dette er vigtigt, men er mindre for Stellaris prober. </li><li> Tæl spots i hver celle. </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells.">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912 (1970).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate.">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li><li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast.">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated.">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li><li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine.">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li><li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Til dato har FISH primært været lav-throughput metode. Anvendelsen af ​​Cy3, Cy3.5, og Cy5 farvestoffer begrænser antallet af gener kan man undersøge i enkelte celler til tre ad gangen. Nogle yderligere sonder er blevet udviklet (Stellaris), men antallet af skelnelige prober er stadig højst syv. For at omgå denne begrænsning, har kombinatoriske mærkning strategier via multiple fluorforer blevet brugt til at skabe stregkoder for forskellige mRNA arter 19,20. Senest brugte Lübeck og Cai optisk og spektral barcoding at kvantificere 32 forskellige arter samtidigt med fisk i enkelte gærceller 19. En begrænsning af denne nylige kombinatorisk tilgang er det kræver anvendelse af super-opløsning mikroskopi. Analysen er nødvendig for at adskille de stregkodede prober er også ganske kompleks. Vi har fundet, at Cy3 og Cy3.5 er at foretrække frem Cy5 for fisk eksperimenter. En af de begrænsninger af Cy5 farvestoffet er dens følsomhedat fotoblegning. Imidlertid har Stellaris nylig udviklet Cy5 varianter, der er annonceret som mere modstandsdygtige over for fotoblegning, og kan afhjælpe dette tekniske spørgsmål. Det er også værd at bemærke, at fisk er en dyr metode til at gennemføre, og at både sanger og Stellaris sonder typisk koste $ 700 - $ 1.000 pr sonde sæt, selv om priserne for kommercielt tilgængelige sonder skal falde i fremtiden. Sparsom af reagenser og effektiv mærkning bringer Singer sonder ned til den nedre ende i pris. En af de store tekniske udfordringer er adskillelsen af ​​enkelte versus multiple sonde spots, som kræver gennemførelse af avancerede spot-bestemmende algoritmer. Dette kan tage omfattende manuel gennemgang at tune billedet analyseparametre til specifikke forsøgsopstillinger. En oversigt over vores beregningsmæssige pipeline med relevante MATLAB funktioner findes i afsnit 7 i protokollen. Dette spørgsmål er noget lindres ved de Stellaris prober, som kun har<html> én etiket pr sonde. Det kræver derfor colokalisering af multiple sonder at se et signal. Fordi FISK nødvendiggør fastsættelse celler, betyder det ikke lette sporing af individuelle celler over tid. Tidligere brugte vi FISH snapshot data til at rekonstruere dynamikken i genekspression i de enkelte metabolisk cykling gær befolkninger 6.. Metabolisk cykling er observeret i pre-udsultede, kontinuerlige kulturer og er kendetegnet ved brede befolkning kollektive svingninger i iltforbrug. Disse svingninger er forbundet med genom-dækkende svingninger af transkripter, der opstår for halvdelen af ​​alle gærgener i forskellige faser af iltforbrug. Vi har forsøgt at bestemme, om metabolisk cykling var til stede i usynkroniserede kontinuerlige gærkulturer. Hvis til stede, bør transkripter, der er anti-korreleret i synkrone populationer også være anti-korreleret i usynkroniserede enkelte celler, og omvendt for korrelerede transkripter. ent &quot;&gt; At rekonstruere dynamik af mRNA produktion i gang, skal de observerede snapshot data sammenlignes med, hvad der forventes af en model af den underliggende adfærd. Der er teoretiske begrænsninger når sådanne&quot; snapshots &quot;af genekspression data kan anvendes til at bestemme den underliggende genekspression dynamik og hvilke slags modeller kan skelnes 21.. For de metaboliske cyklus data, snarere end direkte viser tilstedeværelsen af tidsmæssige svingninger blev statistiske målinger gennemført for at dokumentere, at der rent faktisk er en celleautonome oscillerende program i overensstemmelse med bulk microarray målinger.

Bruger bulk måleteknikker, er det ikke muligt at analysere antallet af transkripter eller transkriptionel aktivitet inden enkeltceller 1.. Brug fluorescerende proteiner drevet af initiativtagerne af interesse som indberettere af genekspression kan løse dette problem til en vis grad, men den tid der kræves for fluorescerende proteiner til at folde tilslører tidlige dynamik. Langlivede fluorescerende proteiner også kan ikke rapportere mRNA levetid. FISH metode kan anvendes til at analysere mRNA under sin fuldstændige livscyklus, fra transkriptionsinitiering i kernen til efterfølgende modning og forfald i enkelte celler, med enkelt-molekyle opløsning. Den originale in situ eksperimenter til at visualisere nukleinsyrer anvendt radiomærkede RNA-prober til sonde DNA-elementer. Disse omfattede visualisere ribosomale DNA i æggestokkene af frøen Xenopus laevis 2 og satellit DNA i musevæv 3.. Den første fluorescerende in situ experprøv dig frem brugt et RNA-molekyle mærket med en fluorofor at sonden bestemte DNA-sekvenser 4.. Den første anvendelse af fluorescerende prober til visualisering RNA in situ var visualiseringen af actin genekspression i kylling muskelvæv kultur 5.. For nylig, i spirende gær, er FISH blevet anvendt til at undersøge svingninger i transkription under gær metaboliske cyklus 6, henfaldet af mRNA&#39;er under cellecyklusprogression 7, og rumlig lokalisering af mRNA-transkripter under mitose 8.. FISH er blevet anvendt i gær til at vise at ukorrelerede udsving i konstitutivt transkriberede gener, som udgør mere end halvdelen af alle gærgener, skyldes ukorrelerede transkriptionsinitiering 9.. I ikke-gær arter, er FISH blevet brugt til at identificere stamcelle markører i mus tarmen 10 og at fastslå, at ufuldstændig penetrans af celleskæbner kan skyldes stokastiske genekspression udsving i C.elegans embryoner 11.. FISH her beskrevne virker ved hybridisering farvning-mærkede, enkeltstrengede DNA-sonder til mRNA meddelelser. Celler afbildes og mRNA&#39;er tælles ved hjælp af en plet-afsløring algoritme. Enkeltstrengede prober kan genereres med et DNA-synteseapparat og derefter mærket (her benævnt Singer prober) eller bestilt kommercielt som præ-mærkede prober (Stellaris prober) 12,13. En væsentlig forskel mellem sanger og Stellaris sonder er, at Singer sonder er længere (~ 50 bp) og er multi-mærket, mens Stellaris sonder er korte (~ 20 bp) med kun én etiket pr probe, som beskrevet af Raj et al 14.. Derudover Stellaris fremgangsmåde bruger mange flere prober per gen end det af Singer (~ 30 versus 5 prober per gen, henholdsvis). Nedenfor giver vi en protokol, der beskriver brugen af ​​begge typer probe. I afsnit 2 giver vi en protokol til mærkning amino-allyl thymidin-holdige sonder wed en udvalgt Cy farvestof. En oversigt over de beregningsmæssige trin, der kræves for at identificere en enkelt mRNA spots findes i afsnit 7..

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

Den Fluorescens in situ hybridisering (FISH) metode gør det muligt at detektere nukleinsyrer i det native cellulære miljø. Her giver vi en protokol for at bruge FISH at kvantificere antallet af mRNA i enkelte gærceller. Celler kan dyrkes i enhver tilstand af interesse og derefter fikseret og gjort permeable. Efterfølgende flere single deoxyoligonucleotider konjugeret til fluorescerende farvestoffer anvendes til at mærke og visualisere mRNA. Diffraktionsbegrænset fluorescens fra enkelt mRNA molekyler kvantificeres ved hjælp af et spot-afsløring algoritme til at identificere og tælle antallet af mRNA per celle. Mens de mere standardiserede kvantificering metoder nordlige blots, RT-PCR og genekspression microarrays giver oplysninger om gennemsnitlige mRNA i tørlastmarkedet befolkning, FISH letter både optælling og lokalisering af disse mRNA i enkelte celler på single-molekyle opløsning.

Figur 3 viser typiske histogrammer beregnet ud fra FISH billeder og anvendes til at bestemme antallet af mRNA&#39;er stede i enkelte celler. En vigtig fordel ved mikroskopi-baserede RNA kvantificering er, at man kan få oplysninger om lokaliseringen af ​​udskrifter. For eksempel brugte vi FISH til at identificere mRNA i enkelte celler med en inducerbar CBF1 allel (Figur 4). Fordi mange mRNA molekyler er til stede på stedet for transkription, er vi i stand til at identificere tilstedeværelsen og placeringen af ​​transskription steder i kernen. Ved at udnytte forskellige farvestoffer til at mærke mRNA&#39;er af forskellige gener, kan man kvantificere flere mRNA-species i de samme celler. At demonstrere dette blev gærceller inkuberet i nærvær af α-faktor og sorbitol. FUS1 transskription (Quasar670 farvestof, rød) er forårsaget af α-faktor. STL1 transskription (Quasar 570 farvestof, grøn) induceres af stigninger i ekstracellulær osmolaritet ( <strong&gt; Figur 5). Figur 4 er et eksempel på FISH med sangeren sonder. Figur 5 er et eksempel på FISH med Stellaris sonder. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figur 1. Skematisk af fisk eksperimentelle procedure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figur 2. Skematisk af billedanalyse pipeline. De endelige pletter bestemmes i yderste højre figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figur 3. Histogram af spot intensiteter for et bestemt gen ved hjælp af Singer prober </strong&gt;. Probe intensiteter er opgjort både inde (rød) og uden (blå) celler. Lavintensive pletter er enten støj eller enlige sonder. Rigtige mRNA beskeder er mærket med flere sonder. Når du bruger Stellaris sonder, enlige sonder er mindre påviselige og dermed tærsklerne og filtrering skal justeres i overensstemmelse hermed. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figur 4.. Repræsentative resultater af Singer FISH procedure. I dette eksperiment er CBF1 transkription aktiveres med en inducerbar promotor 18. Kerner farves blå med DAPI. CBF1 mRNA er kodet med Cy3-mærkede prober. Hvide pile fremhæve tilstedeværelsen af CBF1 transskription steder i kernen. Single mRNA-transkripter er synlige i cytoplasmaet. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figur 5. Repræsentative resultater af Stellaris FISH procedure. Mata gærceller blev samtidig eksponeret til 30 ng / ml α-faktor og 0,75 M sorbitol i 10 minutter og blev samtidig probet for FUS1 (Quasar 670, rød) og STL1 (Quasar 570, grøn) udskrifter. I den markerede boks, kan vi se en celle kun reagerer feromon (FUS1 startsted, rød) og en anden overvejende reagerer på sorbitol (STL1 startsted, grøn).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Denne protokol beskriver en eksperimentel procedure for udførelse af fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) til optælling mRNA i enkelte celler på single-molekyle opløsning.

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...