Abstract
Biology
Den Fluorescens in situ hybridisering (FISH) metode gør det muligt at detektere nukleinsyrer i det native cellulære miljø. Her giver vi en protokol for at bruge FISH at kvantificere antallet af mRNA i enkelte gærceller. Celler kan dyrkes i enhver tilstand af interesse og derefter fikseret og gjort permeable. Efterfølgende flere single deoxyoligonucleotider konjugeret til fluorescerende farvestoffer anvendes til at mærke og visualisere mRNA. Diffraktionsbegrænset fluorescens fra enkelt mRNA molekyler kvantificeres ved hjælp af et spot-afsløring algoritme til at identificere og tælle antallet af mRNA per celle. Mens de mere standardiserede kvantificering metoder nordlige blots, RT-PCR og genekspression microarrays giver oplysninger om gennemsnitlige mRNA i tørlastmarkedet befolkning, FISH letter både optælling og lokalisering af disse mRNA i enkelte celler på single-molekyle opløsning.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved