Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens

Fluorescens in situ hybridisering (FISH)-metoden gjør det mulig å detektere nukleinsyrer i den innfødte cellulære miljø. Her gir vi en protokoll for bruk av FISH å tallfeste antall mRNA i enkle gjærceller. Cellene kan dyrkes i en hvilken som helst tilstand av interesse og deretter fiksert og gjort gjennomtrengelig. Deretter er flere single-strandet deoxyoligonucleotides konjugert til fluorescerende fargestoffer brukes til å merke og visualisere mRNA. Diffraksjon-begrenset fluorescens fra enkelt mRNA molekyler kvantifiseres ved hjelp av en spot-algoritme for å identifisere og telle antall mRNA per celle. Mens de mer vanlige kvantifisering metoder for nordlige blotter, RT-PCR og genuttrykk microarrays gir informasjon om gjennomsnittlig mRNA i bulk befolkningen, letter FISH både telling og lokalisering av disse mRNA i enkeltceller på enkelt-molekyl oppløsning.