Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência

A hibridação in situ fluorescente (FISH), o método permite a detecção de ácidos nucleicos no ambiente celular nativo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a utilização de FISH para quantificar a quantidade de ARNm em células de levedura individuais. As células podem ser cultivadas em qualquer condição de interesse e, em seguida, fixado e tornado permeável. Posteriormente, vários deoxyoligonucleotides single-stranded conjugado com corantes fluorescentes são usados ​​para rotular e visualizar mRNAs. Difracção de fluorescência limitada a partir de moléculas de mRNA individuais é quantificada utilizando um algoritmo de detecção de ponto de identificar e contar o número de mRNAs por célula. Enquanto os métodos de quantificação mais padrão de manchas de Northern, RT-PCR e microarrays de expressão do gene de informação sobre os mRNAs da população média em grandes quantidades, PEIXE facilita tanto a contagem e localização destes ARNm em células individuais com uma resolução de uma única molécula.