Laboratuvarda yapılan araştırma Araştırma Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir - Flanders (FWO; hibe numaraları G.0545.08 ve G.0298.11), Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı (Belçika Bilim Politikası; hibe sayısı P6/28 ve P7/13) ve FWO destekli araştırma topluluğu yerleştirilmiştir. Flanders (FWO) - CDH Araştırma Vakfı bir doktora sonrası adam olduğunu. Yazarlar çok Moleküler ve Hücresel Sinyal (KU Leuven), Dr SP Srinivas (Optometri Indiana Üniversitesi, ABD), Dr Leybaert en laboratuvar (Ghent Üniversitesi) Laboratuvarı tüm mevcut ve eski üyelerine minnettar ve vardır yararlı tartışmalar sağlanan Dr Vinken (VUB), prosedürler optimize veya konneksin hemichannels çalışma için araçlar geliştirilmesi dahil edildi.

1. Kornea Endotel Hücre İzolasyonu Başlamadan önce: göz enucleating sonra yerel bir mezbaha, en kısa zamanda elde edilen taze gözlerle, gelen hücreleri izole edin. Göz maksimum 18 aylık, beş dakika ölüm sonrası ve Earle Dengeli Tuz Çözüm korunmuş bir inek olarak çıkarıldı emin olun - 4% 1 iyot çözeltisi laboratuvara taşınması için ° C. <ol><li> Earle Dengeli Tuz Çözeltisi dışında göz atın - 1% iyot çözeltisi ve bir Petri kabı (100 x 20 mm) yerleştiri...

Bu yazıda, bir mikropipet kullanarak lokalize ve kontrollü mekanik stimülasyon sağlayarak birincil sığır kornea endotel hücrelerinin tek katmanlarını içinde hücreler arası Ca 2 +-dalga yayılımı ölçmek için basit bir yöntem tarif. Mekanik olarak uyarılmış hücreleri +, her ikisi de arası Ca 2 + dalga yayılımının 11,67 sürücü gerekli hücre içi sinyal molekülleri, hücre içi IP 3 ve Ca 2 yerel bir artış ile yanıt verir. ...

Hücreler arası iletişim ve sinyal doku ve tüm organ düzeyinde 1,2 de hücre dışı agonistler yanıt olarak fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Hücreler arası iletişimin en doğrudan yolu boşluğu kavşak oluşumu tarafından oluşturulur. Gap junction 3,4 komşu hücrelerin iki konneksin (Cx) hemichannels (Şekil 1) başkanı kafaya yerleştirme ile oluşan protein kanalları gap junction kanalları plaklar vardır. Ara bağlantılar neden olan ve modüle Ca2 komşu hücreler 6 (Şekil 2) arasında hücre içi mağazalarından +-serbest bırakma., Ca2 + veya IP 3 5 de dahil olmak üzere, en az 1.5 kDa arasında bir moleküler ağırlığa sahip küçük sinyal moleküllerinin geçişine izin Boşluk birleşme kanalları sıkıca redoks modifikasyon ve benzeri gibi, intra-ve intermoleküler protein etkileşimleri ile ve hücresel sinyal süreçler ile düzenlenirfosforilasyon 7. Gjs böylece kimyasal ve elektriksel syncytium olarak hareket eden, bağlı hücrelerin koordine cevabı sağlar. Örneğin, atriyal ve ventriküler kalp miyositleri arasında hareket potansiyelinin yayılmasını Cx-tabanlı GJ kanal 85 aracılığıyla gerçekleşir. Cxs sadece gap junction kanalları olarak rol değil, aynı zamanda eşleşmemiş hemichannels oluşturmak, böylece düzenli iyon kanalları 8-10 (Şekil 1) benzer zarlarında kanalları olarak çalışmıyor. Hemichannels hücre içi ve dışı çevre arasındaki iyon ve sinyal molekülleri değişimini kontrol ederek komşu hücreler arasında parakrin sinyal katılmak. Bir çok hücre tipinde (epitel hücreleri, osteoblastik hücrelerin, astrositlerin, endotelyal hücreler, vb gibi) ve organların (beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal gibi), hücreler arası Ca 2 + dalgalar hücreli yanıtların koordinasyonu için temel olan <sus&gt; 11. Belirli bir hücrede hücre içi Ca 2 + düzeylerinde artış bu hücre ile sınırlı, ama böylece bir hücreler arası Ca 2 +-dalga 12,13 kurulması, çevredeki komşu hücrelere yaymak değildir. Bu hücreler arası Ca 2 + dalgaları syncytium ve düzensizliği patofizyolojik işlemleri 11 ile ilişkili olduğu gibi hücre katmanları fizyolojik düzenlenmesi için önemlidir. Kornea endotel ve epitel, kendi 25-33 gibi farklı grupları 14-24, hücreler arası iletişim mekanizmaları ve rolleri okudu. Olmayan uyarılabilir hücrelerde, kornea endotel hücreleri gibi, hücreler arası iletişim iki ayrı modu 28,29, yani boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim ortaya çıkar. Gap kavşak arası iletişim boşluğu kavşak 7 ile sinyal molekülleri doğrudan bir değişimi içerir. Gap junctional arası iletişim, doku dengesini korumak hücre çoğalması kontrol ve hücre dışı stres 10,34,35 bir senkronize cevap kurmak için önemlidir. Patolojiler bir dizi, gap junction bağlantı nedeniyle hatalı CXS düşürüldü, ve burada boşluk kavşak arası iletişim 36 etkiliyor. Bu çok hücreli organizmalarda boşluğu kavşak arası iletişimin önemini ve etkisini vurgular. Bu yayılabilir dışı haberciler (Şekil 2) sürümü içerdiğinden boşluğu kavşak arası iletişim aksine, parakrin hücreler arası iletişim, hücre-hücre apozisyon bağlı değildir. Sinyal moleküllerinin farklı hücre sinyalizasyon hücre dışı boşlukta serbest bırakılır. Molekül daha sonra belirli bir reseptör proteini ile tespit edilir, hedef hücreye taşınır. Daha sonra reseptör sinyal kompleksi olan bir hücresel yanıtı indüklersinyal, ya da etkisiz hale duyarsızlaştırma çıkarılması ile sonlandırılır. Çıkış lipofilik hücre dışı sinyal haberciler membran nüfuz ve hücre içi reseptörleri üzerinde hareket ederler. Buna karşılık, hidrofilik haberciler yanıt hücrenin plazma zarı çapraz değil, ama sonra hücre içi çevreye sinyal röle yüzey ifade reseptör proteinler, bağlanan bir ligand olarak hareket ederler. Iyon-kanalı-bağlantılı, enzim-bağlı ve G-protein-bağlantılı: hücre yüzeyi reseptör proteinlerinin üç önemli aile bu süreçte yer alırlar. Serbest haberci molekül yakın (parakrin) hedef hücreleri üzerinde, aynı hücre (otokrin) reseptörleri üzerinde hareket edebilir, ya da dolaşım sistemi (endokrin) gerektiren uzak hedef hücreler üzerinde. Kornea endotel 28,29 dahil olmak üzere birçok hücre tipi içinde, hücre içi ATP Ca 2 + dalgalar 37-40 yayılma sürücü büyük hidrofilik, parakrin faktörlerden biridir. DurÇeşitli maddeler olarak kaldırılması ile mekanik deformasyon, hipoksi, inflamasyon veya stimülasyon, ATP kayma gerilmesi, çekme ya da ozmotik 44,45 şişme tepki olarak 41-44 sağlıklı hücrelerden serbest bırakılabilir. Farklı ATP-serbest bırakma mekanizmaları veziküler ekzositozu 44 ve bu, ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcılar, plasmalemmal voltaj bağımlı anyon kanalları 46, P2X7 reseptör kanalı 47,48 yanı sıra, ayrıca nakil mekanizması, bir bolluk da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür konneksin hemichannels 49-52 ve pannexin hemichannels 43,49,53. Hücre dışı ATP ADP, AMP hızla hidrolize olması ve hücre dışı ortamda mevcut ectonucleotidases ile 54,55 adenozin olabilir. Ekstraselüler serbest ATP ve metaboliti ADP 56 difüzyon yoluyla yayılacak. Komşu hücrelerde purinerjik reseptörleri ile bu nükleotidlerin işlemler daha sonra p rolü de ortaya konmuşturarası Ca 2 +-dalgaları 28,37,51 bir ropagation. Purinerjik reseptörlerinin iki farklı sınıflar mevcut: Her iki pürin (ATP, ADP) ve pirimidin (UTP, UDP) nükleotidler en P2-purinoceptors 57 hareket ise adenozin, P1-purinoceptors için başlıca doğal ligand olduğunu. Hücreler arası iletişim gibi kazıma yükleme, boya transferi, IP 3 ve Ca 2 +, mekanik uyaran, vb gibi agonistlerin yerel uncaging gibi farklı yöntemlerle incelenebilir. Burada + dalga yayılımı, tek bir hücrenin mekanik uyarılar ile ortaya çıkarılan Ca 2 çalışma açıklar. Mekanik olarak uyarılmasıyla, Ca 2 +-dalga yayılımı eğitim avantajı + dalga zamanla Ca 2 yayılmasını ölçmek için kolay bir araç sağlar ve kantitatif olarak farklı hücre ön işlemleri karşılaştırarak izin vermektedir. Kornea endotel, bu hücreler arası Ca 2 +-dalgaları eş izintek tabaka gelen koordine yanıt, burada göz içi ameliyat sırasında hücre dışı zorlamalara dayanıklı endotel yardımcı olmayan rejeneratif kornea endotel olası bir savunma mekanizması olarak hareket, ya da bağışıklık ret veya üveit 58,59 sırasında inflamatuvar mediatörlerin maruz üzerine.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Hücreler arası iletişim, beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal içeren organlar ve dokular, çeşitli hücreler arasında fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Deneysel ayarlarında, hücreler arası Ca 2 +-dalgaları tek bir hücreye mekanik bir uyaran uygulanarak elde edebilir. Bu hücre içi sinyal IP molekülleri 3 ve Ca 2 serbest bırakılması yol açar + komşu hücrelere mekanik uyarılmış hücreden + dalga eş Ca 2 yayılma başlatmasını. Arası Ca 2 +-dalga yayılımı kontrol ana moleküler yollar IP 3 doğrudan transferi yoluyla ve ATP serbest bırakılması ile hemichannels tarafından gap junction kanalları tarafından sağlanmaktadır. Özellikleri ve farklı konneksin ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels olarak pannexin izoformlarının düzenlenmesi belirlenmesi ve karakterizasyonu quantificatio izin verdiğin arası Ca 2 +-dalga siRNA ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels inhibitörlerinin kullanımının yayılması. Burada, bir sonucu olarak hücreler arası Ca2 hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyonu ile oluşturulan bir kontrollü ve lokalize mekanik uyarıcıya tepki olarak Fluo4-AM yüklendi primer endotel hücrelerinin mono tabakaları + dalga ölçmek için bir yöntem tarif az 1 mikron bir ipucu çaplı bir micromanipulator kontrollü cam mikropipet ile hücre zarının dokunmadan. Ayrıca birincil sığır kornea endotel hücreleri ve + dalgaları ATP serbest bırakılması ile arası Ca 2 için tahrik güç olarak Cx43-hemichannel aktivite değerlendirmek için model sistem olarak kullanımı izolasyonu açıklar. Son olarak, kullanımı, avantajları, sınırlamalar ve boşluk kavşak kanal ve hemichannel araştırma bağlamında bu yöntemin alternatifleri tartışmak.

Tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yürütülür ve ortaya olan protokol KU Leuven hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır. Sığır kornea endotel hücreleri (BCEC) olarak, fonksiyonel gap junction ifade ve boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim hem de interaktif bir şekilde hücreler arası iletişim önemli katkı, ancak ana yol aracılık parakrin hücreler arası i...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücreler arası Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dalgaları gap junction kanalları ve hemichannels tarafından tahrik edilmektedir. Burada, hücreler arası Ca ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dalgaları yerel bir tek hücreli mekanik uyaran ve özellikleri ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels düzenlenmesi araştırmak için uygulama yanıt olarak hücre mono tabakaları içinde.

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...