Den<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-open Vaseline Gap Spænding-clamp teknik med fluorometri

Summary

Anvendes cut-open Vaseline hul tilgang til at opnå lav støj optagelser af ioniske og gating strømme fra spændingsafhængige ionkanaler udtrykt i Xenopus oocyter med høj opløsning på hurtige kanal kinetik. Med mindre ændringer kan spændingsklemme fluorometri kobles til cut-åben oocyt protokol.

Abstract

Cut-open oocyt Vaseline hul (COVG) spænding clamp teknik giver mulighed for analyse af elektrofysiologiske og kinetiske egenskaber af heterologe ionkanaler i oocyter. Optagelser fra cut-åbne setup er især nyttige til at løse lav størrelsesorden gating strømme, hurtig ionstrømmen aktivering og deaktivering. De vigtigste fordele end de to-elektrode spænding klemme (TEVC) teknik omfatter øget klemme hastighed, forbedret signal-til-støj-forhold, og evnen til at modulere den intracellulære og ekstracellulære miljø.

Her beskæftiger vi det menneskelige hjerte-natrium-kanal (HNA _V 1.5), udtrykt i Xenopus oocytter, at demonstrere cut-åben opsætning og protokol samt ændringer, der er nødvendige til at tilføje spænding klemme fluorometri kapacitet.

Egenskaberne for hurtige aktiverende ionkanaler, såsom HNA _V 1.5, kan ikke fuldt afklaret nær stuetemperatur hjælp TEVC i which helhed af oocyt membran er fastspændt, så spænding kontrol vanskelig. Men i cut-åben teknik, isolering af kun en lille del af cellemembranen tillader hurtig fastspænding kræves præcist at registrere hurtige kinetik samtidig forhindre kanal nedslidning forbundet med patch-clamp-teknikker.

I forbindelse med COVG teknik ionkanal-kinetik og elektrofysiologiske egenskaber kan yderligere analyseres ved anvendelse af spændingsklemme fluorometri hvor protein bevægelse spores via cystein konjugering af ekstracellulært anvendte fluorophorer, insertion af genetisk indkodede fluorescerende proteiner, eller inkorporering af unaturlige aminosyrer ind i området af interesse ^1. Denne ekstra data giver kinetisk information om spændingsafhængige konformationelle rearrangements af protein via ændringer i mikromiljø omkring fluorescerende molekyle.

Introduction

Specialized spændingsfikseringsenheden teknikker tillader registrering af ionstrømme på kontrollerede membranpotentialer. Udbredte to-elektrode spænding klemme (TEVC) og patch clamp teknikker giver pålidelig elektrofysiologiske oplysninger om egenskaberne af mange ionkanaler. Men begge disse metoder har ulemper, der forhindrer erhvervelse af pålidelige data til hurtige spændingsafhængige natrium-kanaler og andre hurtigt aktiverende kanaler i membraner såsom dem af Xenopus oocytter. De Bezanilla og Stefani laboratorier derfor udviklet cut-open Vaseline kløften spænding clamp teknik (COVG) for oocyter ^2. Teknikken har været anvendt bredt til at opta....

Protocol

1.. Initial Setup Udstyr

1. Placer scenen og mikroelektrode manipulator på en vibrationsfri isolation (f.eks en luft tabel) med en omgivende Faradays bur for at undgå elektrisk og mekanisk støj.
2. Lod seks Ag / AgCl pellets til seks-tommer længder af 24 AWG. For en af ​​disse længder (tilsluttes til P1), splejsning i en anden tråd til dannelse af en "Y". På enderne af hver tråd lodde en guld BNC pin, som er inkluderet med forstærkeren.
3. Forbind de fem Ag / AgCl pe.......

Discussion

Cut-open oocyt Vaseline hul spænding clamp teknik giver mulighed for hurtig løsning af data, lav støj, øget kontrol over intern løsning og ekstern løsning sammensætning, og stabile optagelser med relativt lange protokoller ^19. Disse fordele indstille denne teknik bortset fra standard to-elektrode spænding klemme og patch clamp teknikker. Selvom specialudstyr er påkrævet, og protokollen er relativt svært, optræder meget få spørgsmål, når systemet er blevet optimeret. Dette giver mulighed for re.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.