De<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel opengesneden Vaseline Gap voltage-clamp techniek Met fluorometrie

Summary

De opengesneden Vaseline gap benadering wordt gebruikt om lage ruis opnames van ionische en gating stromen van spanningsafhankelijke ionkanalen uitgedrukt in Xenopus oöcyten met een hoge resolutie van snelle kanaal kinetiek verkrijgen. Met kleine wijzigingen, kunnen spanningsklem fluorimetrie worden gekoppeld aan de opengesneden eicel protocol.

Abstract

De opengesneden eicel Vaseline gap (COVG) voltage clamp techniek maakt het mogelijk voor de analyse van elektrofysiologische en kinetische eigenschappen van heterologe ionkanalen in eicellen. Opnames van de opengesneden setup zijn vooral nuttig voor het oplossen van lage magnitude gating stromen, snelle ionenstroom activering en deactivering. De belangrijkste voordelen via twee elektroden spanningsklem (TEVC) techniek omvatten een toename klemsnelheid, verbeterde signaal-ruisverhouding en het vermogen om de intracellulaire en extracellulaire milieu moduleren.

Hier maken we de menselijke cardiale natrium kanaal (HNA _V 1.5), uitgedrukt in Xenopus oöcyten, de opengesneden setup en protocol alsook over eventuele wijzigingen die nodig zijn om spanningsklem fluorometrie mogelijkheden toe te voegen aan te tonen.

De eigenschappen van snelle activerende ionkanalen, zoals HNA _V 1.5, niet volledig kan worden opgelost in de buurt van kamertemperatuur met behulp TEVC, in which het geheel van de eicel membraan geklemd, waardoor spanningsregeling moeilijk. Echter, in de opengesneden techniek, isolatie van slechts een klein deel van het celmembraan zorgt voor de snelle klemmen die nodig zijn om nauwkeurig registreren snelle kinetiek terwijl het voorkomen kanaal vervallen in verband met patch clamp technieken.

In combinatie met de COVG techniek kinetiek van ionkanalen en elektrofysiologische eigenschappen kunnen verder worden getest door voltage clamp fluorometrie, waar eiwithoudende beweging wordt gevolgd via cysteïneconjugatie van extracellulair toegepaste fluoroforen, insertie van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen, of de opname van onnatuurlijke aminozuren in het gebied van belang ^1. Deze extra gegevens levert kinetische informaties spanningsafhankelijke conformationele herschikkingen van het eiwit via veranderingen in de micro-omgeving rond het fluorescent molecuul.

Introduction

Gespecialiseerde spanning klem technieken toestaan ​​dat de opname van de ionische stromen bij een gecontroleerde membraanpotentialen. Wijd gebruikt twee-elektrodespanning klem (TEVC) en patch clamp technieken betrouwbare elektrofysiologische informatie over de eigenschappen van vele ionkanalen. Echter, beide methoden hebben nadelen die het verkrijgen van betrouwbare gegevens voor snelle spanningsafhankelijke natriumkanalen en andere snelle activerende kanalen in membranen zoals die van Xenopus oöcyten voorkomen. De Bezanilla en Stefani laboratoria dus ontwikkelde de opengesneden Vaseline kloof voltage clamp techniek (COVG) voor eicellen ^2. De tec....

Protocol

1. Initial Equipment Setup

1. Plaats het podium en de micro-elektrode manipulator op een vibratie-isolatiesysteem (bijvoorbeeld een lucht tafel) met een omringende kooi van Faraday om elektrische en mechanische ruis te voorkomen.
2. Solderen zes Ag / AgCl pellets tot zes-inch lengtes van 24 AWG draad. Voor een van deze lengte (voor aansluiting op P1), verbinding in een tweede draad een "Y" vormen. Op de uiteinden van elke draad soldeer een gouden BNC pin, die is inbegrepen bij de verste.......

Discussion

De opengesneden eicel Vaseline kloof voltage clamp techniek zorgt voor een snelle oplossing van gegevens, lage ruis, meer controle over interne oplossing en externe oplossing compositie en stabiele opnames over relatief lange protocollen ^19. Deze voordelen stellen deze techniek naast de standaard twee-elektrode voltage clamp en patch clamp technieken. Hoewel gespecialiseerde apparatuur nodig is en het protocol is relatief moeilijk, heel weinig problemen optreden zodra het systeem is geoptimaliseerd. Dit maakt.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.