La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocytes Cut-ouvert vaseline Gap voltage-clamp Technique Avec Fluorimétrie

Summary

L'approche de l'écart de vaseline découpe ouverte est utilisée pour obtenir des enregistrements à faible bruit des courants ioniques et dérogeant canaux ioniques voltage-dépendants exprimées dans des ovocytes de Xenopus à haute résolution de la cinétique de canaux rapides. Avec des modifications mineures, la tension de serrage fluorimétrie peut être couplé au protocole d'ovocytes découpe ouverte.

Abstract

L'écart ovocyte vaseline coupe-ouvert (COVG) technique tension de serrage permet d'analyser les propriétés électrophysiologiques et cinétiques des canaux ioniques hétérologues dans les ovocytes. Les enregistrements de la configuration du coupe-ouvert sont particulièrement utiles pour résoudre des courants faibles ampleur de déclenchement, l'activation du courant ionique rapide, et la désactivation. Les principaux avantages par rapport à la tension à deux électrodes pince (TEVC) comprennent la technique d'augmenter la vitesse de serrage, l'amélioration de rapport signal-sur-bruit, et la capacité de moduler la intracellulaire et milieu extracellulaire.

Ici, nous utilisons le canal sodique cardiaque humain (HNA _V 1.5), exprimé dans des ovocytes de Xenopus, pour démontrer l'installation et le protocole coupe-ouverte ainsi que les modifications qui sont nécessaires pour ajouter la capacité de fluorimétrie tension de serrage.

Les propriétés des canaux ioniques rapides d'activation, comme HNA _V 1.5, ne peuvent pas être entièrement résolus proche de la température ambiante en utilisant TEVC, dans which, la totalité de la membrane de l'ovocyte est serré, ce qui rend difficile le contrôle de la tension. Cependant, dans la technique de découpe ouverte, l'isolement de seulement une petite partie de la membrane cellulaire permet la fixation rapide requis pour enregistrer avec précision une cinétique rapide, tout en empêchant canal course vers le bas associée à des techniques de patch-clamp.

En liaison avec la technique de COVG, la cinétique des canaux ioniques et les propriétés électrophysiologiques peuvent encore être dosée à l'aide de la tension de serrage fluorimétrie, où le mouvement de la protéine est suivi par l'intermédiaire de la cystéine conjugaison de fluorophores extracellulaire appliqués, l'insertion de protéines fluorescentes codés génétiquement, ou l'incorporation d'acides aminés non naturels dans la région d'intérêt ^1. Ces données supplémentaires donne des informations sur les réarrangements conformationnels cinétique de la protéine dépendant de la tension par des changements dans le microenvironnement autour de la molécule fluorescente.

Introduction

Techniques spécialisées tension de serrage permettent l'enregistrement des courants ioniques à des potentiels de membrane contrôlées. Largement utilisé tension à deux électrodes pince (TEVC) et des techniques de patch-clamp fournissent des informations électrophysiologique fiable sur les propriétés de nombreux canaux ioniques. Cependant, ces deux méthodes présentent des inconvénients qui empêchent l'acquisition de données fiables pour les canaux sodiques voltage-dépendants rapides et d'autres canaux d'activation rapide dans les membranes tels que ceux des ovocytes de Xenopus. Les laboratoires Bezanilla et Stefani donc développé la technique é....

Protocol

Une. Installation du matériel initial

1. Placer le stade et le manipulateur de micro-électrodes sur un système d'isolation de vibrations (par exemple une table d'air) avec une cage de Faraday entoure afin d'éviter le bruit électrique et mécanique.
2. Soudez six pastilles Ag / AgCl à longueurs de six pouces de 24 AWG. Pour l'une de ces longueurs (pour être relié à P1), raccord dans un deuxième fil pour former un «Y». Sur les extrémités de chaque fil souder un goujon .......

Discussion

L'ovocyte vaseline tension d'espace technique du clamp de coupe-ouverte permet la résolution rapide des données, à faible bruit, un contrôle accru sur la solution interne et la composition de la solution externe, et des enregistrements stables sur de relativement longues protocoles ^19. Ces avantages mis cette technique en dehors de la pince de tension à deux électrodes standard et des techniques de patch-clamp. Bien que l'équipement spécialisé est nécessaire et le protocole est relativem.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.