Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

Summary

Die aufgeschnittenen Vaseline Lücke Ansatz werden geringe Geräuschaufnahmen von ionischen und Anschnittströme von spannungsabhängigen Ionenkanälen in Xenopus-Oozyten mit hoher Auflösung von schnellen Kanal Kinetik ausgedrückt zu erhalten. Mit geringen Modifikationen können Spannungsklemm Fluorometrie an den aufgeschnittenen Oozyte Protokoll gekoppelt werden.

Abstract

Die aufgeschnittenen Oozyte Vaseline Spalt (COVG) Voltage-Clamp Technik erlaubt die Analyse der elektrophysiologischen und kinetischen Eigenschaften von heterologen lonenkanäle in Oozyten. Aufnahmen aus der aufgeschnittenen Setup sind besonders nützlich für die Lösung geringer Größe Gating Strömungen, schnelle Ionenstrom-Aktivierung und Deaktivierung. Die Hauptvorteile gegenüber der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC)-Technik sind eine erhöhte Klemmgeschwindigkeit, verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis, und die Fähigkeit, die intrazelluläre und extrazelluläre Milieu modulieren.

Hier verwenden wir die menschlichen kardialen Natriumkanals (HNA _V 1.5), ausgedrückt in Xenopus-Oozyten, die aufgeschnittenen und Setup-Protokoll sowie Änderungen, die erforderlich sind, um Spannungsklemme Fluorometrie Fähigkeit hinzufügen demonstrieren.

Die Eigenschaften der schnellen Aktivierung von Ionenkanälen, wie z. B. 1,5 _V HNA, nicht vollständig in der Nähe von Raumtemperatur gelöst werden mit TEVC in which die Gesamtheit der Eizelle Membran eingespannt ist, wodurch Spannungssteuerung schwierig. In der aufgeschnittenen Technik, Isolierung von nur einem kleinen Teil der Zellmembran ermöglicht jedoch für den Schnellspann erforderlich, genau zu erfassen, während verhindert schnelle Kinetik Kanal Auslauf mit Patch-Clamp-Techniken verbunden sind.

In Verbindung mit der COVG Technik Ionenkanal Kinetik und elektrophysiologischen Eigenschaften können durch Verwendung von Spannungsklemm Fluorometrie, wo Proteinbewegung wird über Cystein Konjugation von extrazellulär aufgebracht Fluorophore, Insertion von genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen oder den Einbau von unnatürlichen Aminosäuren getestet werden verfolgt in der Region von Interesse ^1. Diese zusätzliche Daten liefert kinetische Informationen über spannungsabhängige Konformationsänderungen des Proteins über Veränderungen in der Mikroumgebung des fluoreszierenden Moleküls.

Introduction

Specialized Spannungsklemmtechniken erlauben die Aufzeichnung von Ionenströmen bei kontrollierten Membranpotentialen. Weit verbreitet Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) und Patch-Clamp-Techniken liefern zuverlässige Informationen über die elektrophysiologischen Eigenschaften vieler Ionenkanäle. Jedoch haben beide Verfahren Nachteile, die den Erwerb von zuverlässigen Daten für schnellen spannungsabhängigen Natriumkanäle und andere schnell aktivierenden Kanäle in den Membranen, wie sie von Xenopus Oozyten zu verhindern. Die Bezanilla und Stefani Laboratorien entwickelt folglich die aufgeschnittenen Spalt Vaseline Voltage-Clamp Technik (COVG) für Oozyten

Protocol

1. Erste Geräte-Setup

1. Legen Sie die Bühne und die Mikroelektrode Manipulator auf einer Schwingungsisolationssystem (zB eine Klimatabelle) mit einer umgebenden Faraday-Käfig, um elektrische und mechanische Störungen zu vermeiden.
2. Löten sechs Ag / AgCl Pellets zu sechs-Zoll-Längen von 24 AWG. Für eine dieser Längen (bis zu P1 angeschlossen werden), Splice in einem zweiten Draht, ein "Y" bilden. An den Enden jedes Drahtes löten Gold BNC Stift, der mit dem Verstärker enthalt.......

Discussion

Die aufgeschnittenen Eizelle Vaseline Spaltspannung Clamp-Technik ermöglicht eine schnelle Auflösung der Daten, geringes Rauschen, mehr Kontrolle über interne und externe Lösung Lösung Zusammensetzung und stabile Aufnahmen über längere Protokolle ^19. Diese Vorteile setzen diese Technik abgesehen von der Standard-Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-und Patch-Clamp-Technik. Obwohl spezielle Ausrüstung erforderlich ist, und das Protokoll ist relativ schwierig, treten sehr wenige Probleme, sobald das System opt.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.