<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

Summary

גישת פער זלין החתך פתוח משמשת להשגת הקלטות רעש נמוכות של זרמים יוניים וgating מתעלות יונים מתח תלוי מבוטאים בביציות Xenopus עם רזולוציה גבוהה של קינטיקה ערוץ מהר. עם שינוי קל, fluorometry מהדק מתח יכול להיות מצמידים את פרוטוקול ביצית החתך פתוח.

Abstract

פער זלין ביצית החתך פתוח (COVG) טכניקת מהדק מתח מאפשרת ניתוח של מאפייני אלקטרו והקינטית של תעלות יונים Heterologous בביציות. הקלטות מהגדרת החתך פתוח הן שימושיות במיוחד לפתרון זרמים נמוכים gating הגודל, הפעלה נוכחית יונית מהירה, ושחרור משרות. היתרונות העיקריים על פני מהדק מתח שתי אלקטרודות טכניקה (TEVC) כוללים מהירות מוגברת מהדק, יחס אות לרעש משופר, והיכולת לווסת את תאית וסביבה תאית.

כאן, אנחנו מעסיקים ערוץ נתרן לב האנושי (HNA _V 1.5), הביע ב ביציות Xenopus, כדי להדגים את הגדרת החתך פתוח ופרוטוקול, כמו גם שינויים דרושים כדי להוסיף את יכולת fluorometry מהדק מתח.

המאפיינים של ערוצים מהירים להפעלת יון, כגון HNA _V 1.5, לא ניתן לפתור באופן מלא ליד טמפרטורת חדר באמצעות TEVC, באשרשעות השלמות של קרום הביצית הוא הידק, מה שהופך את בקרת מתח קשה. עם זאת, בטכניקת החיתוך פתוח, בידוד של רק חלק קטן מקרום התא מאפשר להידוק המהיר יידרש לרשום במדויק קינטיקה מהירה תוך מניעת ערוץ מוזנח הקשורים לטכניקות תיקון מהדק.

בשילוב עם טכניקת COVG, קינטיקה ערוץ יון ומאפייני אלקטרו ניתן assayed נוסף באמצעות fluorometry מהדק מתח, שבו תנועת חלבון היא מעקב באמצעות נטיית ציסטאין של fluorophores מיושם extracellularly, החדרה של חלבוני ניאון מקודדים גנטי, או שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות לאזור של עניין ^1. נתונים נוספים זה מניב מידע קינטית על שחלופי קונפורמציה מתח תלוי של החלבון באמצעות שינויים בmicroenvironment המקיף את מולקולת הניאון.

Introduction

טכניקות הידוק מתח מיוחדות תאפשר ההקלטה של ​​זרמים יוניים בפוטנציאל קרום מבוקר. שימוש נרחב מהדק שתי אלקטרודות מתח (TEVC) וטכניקות תיקון מהדק לספק מידע אלקטרו אמין על המאפיינים של תעלות יונים רבות. עם זאת, שתי שיטות אלה יש חסרונות שמונעים הרכישה של נתונים מהימנים לערוצים במהירות מתח מגודרת נתרן וערוצים להפעלה מהירה אחרים בממברנות כגון אלה של ביציות Xenopus. מעבדות Bezanilla וסטפאני וכתוצאה מכך פיתחו את טכניקת החיתוך פתוח מהדק מתח פער זלין (COVG) לביציות ^2. הטכניקה כבר מיושמת באופן נרחב כדי להקליט, Na ^+, K ^+, וCa ² ערוצים ^{+ 3-8.}

Protocol

1. התקנת ציוד ראשונית

1. מניחים את הבמה ומניפולטור microelectrode על מערכת רטט בידוד (למשל שולחן אוויר) עם כלוב פאראדיי המקיף כדי למנוע רעש חשמלי ומכאני.
2. הלחמה שישה כדורי Ag / AgCl לאורכים של שישה סנט?.......

Discussion

טכניקת מהדק החתך פתוח וזלין ביצית מתח פער מאפשרת פתרון מהיר של נתונים, רעש נמוך, שליטה מוגברת על פתרון פנימי והרכב פתרון חיצוני, והקלטות יציבים לאורך פרוטוקולים ארוכים יחסית ^19. יתרונות אלה שנקבעו בטכניקה זו מלבד המהדק הסטנדרטי שתי אלקטרודות מתח וטכניקות תיקון ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.