Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

Summary

L'approccio gap vaselina cut-aperto viene utilizzato per ottenere bassi registrazioni sonore di correnti ioniche e gating di canali ionici voltaggio-dipendenti espressi in oociti di Xenopus con alta risoluzione di canale cinetiche veloci. Con piccola modifica, morsetto di tensione fluorometria può essere accoppiato al protocollo ovocita cut-open.

Abstract

L'ovocita vaselina gap cut-open (COVG) clamp di tensione permette l'analisi delle proprietà elettrofisiologiche e cinetiche dei canali ionici eterologa in oociti. Registrazioni dalla configurazione cut-open sono particolarmente utili per risolvere basse correnti di magnitudo gating, rapida attivazione corrente ionica e disattivazione. I principali vantaggi rispetto al morsetto di tensione a due elettrodi (TEVC) tecnica includono maggiore velocità morsetto, miglior rapporto segnale-rumore, e la capacità di modulare la intracellulare ed extracellulare.

Qui, impieghiamo canale del sodio cardiaco umano (HNA 1,5 _V), espresso in oociti di Xenopus, per dimostrare la configurazione e protocollo cut-open nonché modifiche necessarie per aggiungere capacità fluorometria morsetto di tensione.

Le proprietà dei canali ionici veloci attivanti, come HNA 1,5 _V, non possono essere completamente risolti a temperatura ambiente usando TEVC, in which la totalità della membrana dell'oocita è serrato, rendendo difficile il controllo della tensione. Tuttavia, nella tecnica cut-aperto, separazione di solo una piccola porzione della membrana cellulare consente il bloccaggio rapido necessaria per registrare accuratamente cinetica veloce evitando canale run-down associato a tecniche di patch clamp.

In concomitanza con la tecnica COVG, cinetica del canale ionico e proprietà elettrofisiologiche possono essere ulteriormente analizzati mediante morsetto fluorometria tensione, in cui il movimento proteina viene monitorato tramite cisteina coniugazione di fluorofori applicate extracellulare, inserimento di proteine ​​fluorescenti geneticamente codificati, o l'incorporazione di amminoacidi non naturali nella regione di interesse ^1. Questi dati aggiuntivi produce informazioni cinetiche su voltaggio-dipendenti riarrangiamenti conformazionali della proteina attraverso cambiamenti nel microambiente circostante la molecola fluorescente.

Introduction

Tecniche tensione di serraggio specializzati permettono la registrazione di correnti ioniche a potenziali di membrana controllate. Ampiamente usato voltage clamp a due elettrodi (TEVC) e tecniche di patch clamp forniscono informazioni elettrofisiologiche attendibili sulle proprietà di molti canali ionici. Tuttavia, entrambi questi metodi hanno inconvenienti che impediscono l'acquisizione di dati affidabili per i canali del sodio voltaggio-dipendenti veloci e altri canali attivanti veloce nelle membrane come quelle di ovociti di Xenopus. I laboratori Bezanilla e Stefani quindi sviluppato la tecnica del clamp di tensione gap vaselina cut-open (COVG) per ov....

Protocol

1. Setup Equipaggiamento iniziale

1. Posizionare il palco e il manipolatore microelettrodo su un sistema di vibrazione-isolamento (ad esempio una tabella d'aria) con una gabbia di Faraday circostante per evitare disturbi elettrici e meccanici.
2. Saldare sei pellets Ag / AgCl a lunghezze sei pollici di 24 AWG. Per una di queste lunghezze (da collegare P1), splice in un secondo filo per formare una "Y". Alle estremità di ogni filo saldare un oro BNC perno, che è incluso con l'a.......

Discussion

L'ovocita vaselina tensione gap clamp cut-open consente una rapida risoluzione dei dati, a basso rumore, aumentato il controllo sulla soluzione interna e la composizione soluzione esterna, e registrazioni stabili nel relativamente lunghi protocolli ^19. Questi vantaggi impostate questa tecnica a parte il voltage clamp a due elettrodi standard e le tecniche di patch clamp. Sebbene attrezzature specializzate è necessaria e il protocollo è relativamente difficile, molto pochi problemi si verificano quando i.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.