ザ·<em&gt;アフリカツメガエル</em蛍光測定で&gt;卵母細胞のカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法

Summary

カットオープンワセリンギャップアプローチは、高速チャネル動態の高解像度で、アフリカツメガエル卵母細胞で発現電位依存性イオンチャネルからのイオンおよびゲート電流の低ノイズの録音を得るために使用される。マイナーな変更を加えて、電圧クランプ蛍光法は、カットオープン卵母プロトコルに結合することができる。

Abstract

カットオープン卵母ワセリンギャップ（COVG）電圧クランプ技術は、卵母細胞における異種イオンチャネルの電気生理学的および動力学的特性の分析を可能にする。カットオープンセットアップからの記録は、低振幅ゲート電流、急速なイオン電流の活性化、および非アクティブ化を解決するために特に有用である。 2電極電圧クランプ（TEVC）技術上の主な利点は、増加したクランプ速度、改善された信号対雑音比、および細胞内および細胞外環境を調節する能力が挙げられる。

ここでは、人間の心臓のナトリウムチャネル（HNA _V 1.5）を採用し、切り開い設定やプロトコルだけでなく、電圧クランプ蛍光測定機能を追加するために必要な変更を示すために、 アフリカツメガエル卵母細胞で発現。

このようなHNA _V 1.5の速度で活性化イオンチャネルの特性は、完全にwhicで、TEVCを用いて室温付近では解決できないhは、卵母細胞膜の全体が電圧制御を困難にクランプされる。しかしながら、カットオープン技術では、細胞膜の小部分のみの単離は、パッチクランプ技術に関連するチャネルランダウンを防止しつつ、正確に速い反応速度を記録するために必要な迅速な締付けを可能にする。

COVG法、イオンチャネル動態及び電気生理学的特性に関連してさらにタンパク質の動きが細胞外に適用さフルオロフォア、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質の挿入、または非天然アミノ酸の組込みのシステインコンジュゲーションを介して追跡される電圧クランプ蛍光法を用いてアッセイすることができる関心¹の領域へ。この追加データは、蛍光分子を取り巻く微小環境の変化を介してタンパク質の電位依存性のコンホメーションの再編成についての速度論的な情報が得られます。

Introduction

特殊な電圧クランプ技法を制御膜電位におけるイオン電流の記録を可能にする。広く使用される2つの電極電圧クランプ（TEVC）およびパッチクランプ技術は、多くのイオンチャネルの電気生理学的特性に関する信頼できる情報を提供する。しかしながら、これらの方法の両方は、高速電位依存性ナトリウムチャネルおよびアフリカツメガエル卵母細胞のもののような膜における他の高速活性化チャネルに対する信頼性のあるデータの取得を妨げる欠点を有する。 Bezanillaとステファニー·ラボラトリーズは、結果的に卵母細胞²のカットのオープンワセリンギャップ電圧クランプ法（COVG）を開発しました。技術をNa ^{+、K +、}およびCa ^{2 +}チャネル^3-8を記録するために広く適用されている。

COVG記録中に、異種タンパク質を発現する卵母細胞膜は、3つの領域に分割されている。イオン電流のデータは次のように卵母細胞の上部領域から記録されている上部領域を取り囲む浴を容易かつ迅速に変更することができるコマンド電位にクランプされる。中間領域の頂部領域⁹と同電位にクランプされることにより、リーク電流を保護します。卵母細胞開度（カットオープン）サポニン溶液またはカニューレの使用を介して発生する場所底部領域である。化学的または底部領域での膜のマニュアル開はグランドにクランプされた内部....

Protocol

1。初期の機器セットアップ

1. 電気的および機械的ノイズを防ぐために、周囲のファラデーケージと振動絶縁システム（ 例えば 、空気テーブル）上のステージと微小電極マニピュレータを配置します。
2. 24 AWGワイヤの6インチの長さに6銀/塩化銀ペレットを半田付けします。これらの長さのいずれか（P1に接続される）は、「Y」を形成する第2の配線にスプライス。各ワイヤ?.......

Discussion

カットオープン卵母細胞ワセリンギャップ電圧クランプ法は、データの迅速な解決を可能にし、低ノイズで、比較的長いプロトコル¹⁹に係る内部液と外液組成を制御し、安定した録画を増加させた。これらの利点は別として標準の2電極電圧クランプおよびパッチクランプ技術から、この手法を設定してください。特殊な装置が必要であり、プロトコルが比較的困難であるされていま?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.