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Summary

절개 바셀린 갭 접근 방식은 빠른 채널 반응 속도의 높은 해상도와 Xenopus의 난자에서 발현 전압 - 의존성 이온 채널에서 이온 및 게이팅 전류의 낮은 잡음 녹음을 얻는 데 사용됩니다. 사소한 변형에, 전압 클램프 형광 측정은 절개 난자 프로토콜에 연결될 수있다.

Abstract

절개 난자 바셀린 갭 (COVG) 전압 클램프 기술은 난자의 이종 이온 채널의 전기 생리학과 운동 특성을 분석 할 수 있습니다. 절개 설정에서 녹음 낮은 크기의 게이트 전류, 빠른 이온 전류의 활성화 및 비활성화를 해결하는 데 특히 유용합니다. 두 전극 전압 클램프 (TEVC) 기법을 통해 주요 장점은 증가 된 클램프 속도, 개선 된 신호대 잡음비, 및 세포 내 및 세포 외 환경을 조절하는 능력을 포함한다.

여기서는 절개 설정 및 프로토콜뿐만 아니라 전압 클램프 형광 측정 기능을 추가하는 데 필요한 변형을 설명하기 위해, (HNA V 1.5), 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포에서 발현 인간 심장 나트륨 채널을 이용한다.

이러한 HNA V 1.5 빨리 활성화 이온 채널의 특성은 완전히 whic에서 TEVC를 사용하여 상온 근처에 해결 될 수없는난자의 세포막의 시간 전체가 전압 제어가 어려워 고정된다. 그러나 절개 기술에서 세포막의 단지 작은 부분의 절연은 패치 클램프 기술과 연관된 채널 황폐 방지하면서 정확하게 빠른 반응 속도를 기록 할 필요 급속한 클램핑을 허용한다.

COVG 기술, 이온 채널 속도론 및 전기 생리 특성과 함께 추가로 단백질 움직임이 세포 외로 적용 형광체, 유전자에 의해 코딩 형광 단백질의 삽입 또는 부자연 아미노산의 혼입 시스테인 공액 통해 추적되는 전압 클램프 형광 측정을 사용하여 정량 할 수있다 관심 1의 영역으로. 이러한 추가적인 데이터는 형광 분자를 둘러싸는 미세 변화를 통한 단백질의 전압 의존성 구조적 재 배열 대해 운동 정보를 산출한다.

Introduction

특수 전압 클램핑 기술은 제어 된 막 전위에서 이온 전류의 기록을 허용한다. 널리 두 전극 전압 클램프 (TEVC)를 사용하고 패치 클램프 기술은 많은 이온 채널의 특성에 대한 신뢰성있는 전기 생리 정보를 제공한다. 그러나, 이러한 방법은 모두 빠른 전압 문 나트륨 채널과 같은 Xenopus의 난자의 세포막에있는 것과 같은 다른 빠른 활성화 채널에 대한 신뢰할 수있는 데이터의 취득을 방지 단점이 있습니다. Bezanilla과 스테파니 연구소는 따라서 난자 2의 절개 바셀린 갭 전압 클램프 기술 (COVG)를 개발했다. 기법은, 나 +, K +, 및 칼슘 2 + 채널 3-8을 기록 널리 적용되어왔다.

COVG 기록하는 동안, 이종 단백질 발현 난자의 막을 세 지역으로 나누어 져 있습니다. 이온 전류 데이터로서 난자의 상부 영역으로부터 기록된다정상 영역을 둘러싸 욕을 용이하고 신속하게 변경 될 수있는 명령 전위에 클램프된다. 중간 영역의 상부 영역 (9)과 동일한 전위에 클램프 됨으로써 누설 전류에 대하여 가드. 난자 개구 (절개) 사포닌 용액 또는 정맥의 사용을 통해 발생하는 위치를 하단 영역입니다. 화학적 ....

Protocol

1. 초기 장비 설치

  1. 전기 및 기계 소음을 방지하기 위해 주변 패러데이 케이지 진동 격리 시스템 (예를 들면, 공기 테이블)에 무대와 미세 조작기를 놓습니다.
  2. 24 AWG 와이어의 6 인치 길이에 여섯 자세 / AgCl을 알약을 납땜. 이들 중 하나의 길이 (P1에 접속되는) 제 2 와이어의 접합부는 "Y"를 형성한다. 각 와이어의 끝에 앰프에 포함 된 금 BNC 핀을 납땜.
  3. 욕실 / 가드 h.......

Representative Results

도 4는 디스플레이 사포닌 용액으로서 난자의 투과성의 변화는 난자의 ​​바닥 부에인가된다. 5 사포닌 permeabilization 다음 확산에 의해 세포 내 용액의 교환 율을 보여 도표. 20 ~ 40 분은 정상 상태 2,18에 와서해야합니다.

기록 프로토콜에서 생성 된 그림 6A 쇼 흔적. 그림은 전압 프로토콜 (삽입)에 대한 응답 (P/-8 누출.......

Discussion

절개 난자 바셀린 갭 전압 클램프 기술은 데이터의 신속한 해결이 가능, 낮은 노이즈, 상대적으로 긴 프로토콜 19을 통해 내부 솔루션 및 외부 용액 조성물을 제어하고, 안정된 레코딩을 증가했다. 이러한 장점 떨어져 표준 두 전극 전압 클램프 및 패치 클램프 기술에서이 기술을 설정합니다. 전문 장비가 필요하고 프로토콜이 상대적으로 어려운 있지만 시스템이 최적화되면, 아주 몇 가지.......

Acknowledgements

모든 세인트 루이스 심장 분자 공학 연구실에있는 워싱턴 대학의 구성원. 버로우즈는 과학 인터페이스에서 기금 경력 상을 오신 것을 환영합니다 - 1010299을 (JS에).

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
External SolutionBrandCatalog Number[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)Sigma-AldrichM200425mM
MES Sodium SaltSigma-AldrichM505790mM
HEPESResearch Products InternationalH7503020mM
Calcium hydroxideSigma-Aldrich2392322mM
MES HydrateSigma-AldrichM8250variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)Sigma-AldrichM2004105mM
MES Sodium SaltSigma-AldrichM505710mM
HEPESResearch Products InternationalH7503020mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)Sigma-AldrichE43782mM
MES HydrateSigma-AldrichM8250variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KClSigma-Aldrich221473110mM
Magnesium chlorideSigma-AldrichM82661.5mM
Calcium ChlorideCaissonC0210.8mM
HEPESResearch Products InternationalH7503010mM
Pipet Solution
KClSigma-Aldrich2214733M
Saponin Solution
SaponinSigma-Aldrich470360.125g
Internal SolutionSee above50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)Sigma-AldrichM2004100ml of 1M
HEPESResearch Products InternationalH750301.2g
MES HydrateSigma-AldrichM8250variable (pH to 7.4)
Granulated AgarResearch Products InternationalA202503%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solutionsee above40ml
Water60ml
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
High Performance Oocyte ClampDaganCA-1B
Data Acquisition SystemAxon CNS Digidata 1440A
OscilloscopeTektronix TDS 210
Rack Power FilterAPC G5
Heating/Cooling Bath Temperature ControllerDaganHCC-100A
PCDellOptiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp SoftwareMolecular Devices, LLCpCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop PlatformTMC64 SERIES
TMC Vibration Control Air TableTMC20 Series 
V1/I Electrode Data CollectorDaganpart of CA-1B
MX10L MicromanipulatorSiskiyouMX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)Daganpart of CA-1B
MicroscopeOmanoOM2300S-JW11
Temperature Control BathCustom or DaganCustom or HE-204CCustom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet ContainerCustomCustomCustom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mmWarnerE-206
External Oocyte BathCustom or DaganCustom or CC-1-T-LBCustom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte BathCustom or DaganCustom or CC-TG-NDCustom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled ElectrodesWarnerG150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and BathSiskiyouSD-1280P
Fiber-LiteDolan-JennerLMI-600
Regular BleachClorox470174-764
Xenopus laevis OocytesNascoLM535M (sexually mature females)
90 Na+ External SolutionSee Solutions sheet
10 Na+ Internal SolutionSee Solutions sheet
3 M KCLSee Solutions sheet
SaponinSigma-Aldrich47036
NMDG Storage SolutionSee Solutions sheet
5mL transfer pipetsSciMartGS-52
Modified KCl electrode injectorBD309659Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
MicrovaccumCustomCustom
ForcepsVWR63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)VWR53502-222
Deionized Water Squirt BottleVWR16649-911
Vaseline Petroleum JellyFisher Scientific19-086-291 
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF MicroscopeNikonEclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR ObjectiveNikonN40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright MicroscopesSutter InstrumentsMT500-586
External VCF Oocyte BathCustomCustom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte BathCustomCustom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control BathCustomCustom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.

References

  1. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
  2. Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte vol....

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