Den<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter Cut-open vaselin Gap Voltage-klemme teknikk med fluorometri

Summary

Cut-open vaselin gap tilnærming blir brukt for å oppnå lavt støynivå innspillinger av ioniske og gating strømmer fra spenningsavhengige ionekanaler uttrykt i Xenopus oocytter med høy oppløsning på raske kanalkinetikk. Med mindre modifikasjoner, kan spennings-klemme fluorometri sammenkoples med cut-åpen oocytten protokoll.

Abstract

Cut-open eggcelle vaselin gap (COVG) spenning klemme teknikken gjør det mulig for analyse av elektrofysiologiske og kinetiske egenskaper av heterologe ionekanaler i ubefruktede egg. Opptak fra cut-åpen oppsett er spesielt nyttig for å løse lave magnitude gating strømninger, rask ionisk nåværende aktivering og deaktivering. De viktigste fordeler i forhold til de to-elektrodespenningsklemme (TEVC) teknikk inkluderer økt klemme hastighet, forbedret signal-til-støy-forhold, og evnen til å modulere den intracellulære og ekstracellulære miljø.

Her benytter vi den menneskelige hjertenatriumkanalen (HNA _V 1.5), uttrykt i Xenopus oocytter, for å demonstrere cut-åpen oppsett og protokoll samt endringene som er nødvendige for å legge spenning klemme fluorometri evne.

Egenskapene til raske aktiverings ionekanaler, som for eksempel HNA _V 1.5, ikke fullt ut kan løses nær romtemperatur ved hjelp TEVC, i hh helheten av oocytten membranen er fastklemt, slik at spenningskontroll vanskeligere. Imidlertid, i cut-åpen teknikk, isolering av bare en liten del av cellemembranen tillater hurtig fastspenning nødvendig for å nøyaktig registrere hurtige kinetikk, mens den forhindrer kanal nedslitt forbundet med patch clamp-teknikker.

I forbindelse med COVG teknikk, ionekanal-kinetikk og elektrofysiologiske egenskaper kan bli ytterligere analysert ved hjelp av spennings-klemme fluorometri, hvor protein bevegelsen spores via cystein konjugering av ekstracellulært anvendt fluoroforer, innsetting av genetisk kodede fluorescerende proteiner, eller inkorporering av unaturlige aminosyrer inn i regionen av interesse ^en. Denne tilleggsdata gir kinetisk informasjon om spenningsavhengige konformasjonsforandringer rearrangements av proteinet gjennom endringer i mikromiljøet som omgir det fluorescerende molekyl.

Introduction

Spesialiserte spenningsklemmeteknikk tillater opptak av ioniske strømmer ved kontrollerte membranpotensialer. Mye brukt to-elektrode spenningsklemmen (TEVC) og patch clamp teknikker gir pålitelig elektrofysiologisk informasjon om egenskapene til mange ionekanaler. Men begge disse metodene har ulemper som hindrer anskaffelse av pålitelige data for rask spenningsstyrte natriumkanaler og andre fast aktiverings kanaler i membraner som for eksempel de av Xenopus oocytter. De Bezanilla og Stefani laboratorier følgelig utviklet cut-åpen vaselin gap spenning klemme teknikk (COVG) for egg ^2. Teknikken har blitt brukt mye til å spille inn, Na ^+, ....

Protocol

En. Initial Setup Utstyr

1. Plasser scenen og microelectrode manipulator på et vibrasjons isolert system (f.eks en luft tabell) med et området Faraday bur for å hindre elektrisk og mekanisk støy.
2. Lodd seks Ag / AgCl pellets til seks-tommers lengder av 24 AWG-ledning. Til en av disse lengder (for å være koblet til P1), spleise i en andre ledning for å danne en "Y". På endene av hver ledning lodde en gull BNC-pin, som følger med forsterkeren.
3. Koble de fem Ag / AgCl p.......

Discussion

The cut-open oocyte Vaseline gap voltage clamp technique allows for rapid resolution of data, low noise, increased control over internal solution and external solution composition, and stable recordings over relatively long protocols¹⁹. These advantages set this technique apart from the standard two-electrode voltage clamp and patch clamp techniques. Although specialized equipment is required and the protocol is relatively difficult, very few issues occur once the system has been optimized. This allows for rep.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.