O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

Summary

A abordagem lacuna vaselina cut-aberto é usado para obter baixos gravações de ruídos de correntes iônicas e gating de canais iônicos dependentes de voltagem expressos em oócitos de Xenopus com alta resolução de cinética de canais rápidos. Com modificações menores, fixador de tensão fluorometria pode ser acoplado com o protocolo do oócito corte aberto.

Abstract

A vaselina oócito lacuna cut-aberto (COVG) técnica braçadeira de tensão permite a análise das propriedades eletrofisiológicas e cinéticos de canais iônicos heterólogas em oócitos. Gravações do setup cut-aberto são particularmente úteis para a resolução de correntes de baixa magnitude gating, rápida ativação corrente iônica e desativação. As principais vantagens sobre a tensão de dois eléctrodos de aperto (TEVC) técnica incluem o aumento da velocidade de fixação, uma melhor relação sinal-ruído, e a capacidade de modular o intracelular e meio extracelular.

Aqui, nós empregamos o canal de sódio cardíaco humano (HNA _V 1.5), expressa em oócitos de Xenopus, para demonstrar a configuração cut-aberto e protocolo, bem como as modificações que são necessárias para adicionar capacidade de fluorometria braçadeira de tensão.

As propriedades dos canais iônicos de ativação rápida, como HNA _V 1.5, não pode ser totalmente resolvido em temperatura ambiente usando TEVC, em which, a totalidade da membrana do oócito é apertado, tornando difícil o controlo da tensão. No entanto, na técnica de corte-aberto, o isolamento de apenas uma pequena porção da membrana celular permite a fixação rápida necessária para registar com precisão cinética rápida evitando canal degradado associado com técnicas de fixação de membranas.

Em conjunção com a técnica COVG, cinética do canal de iões e propriedades electrofisiológicas pode ser ainda analisada utilizando fluorimetria fixador de tensão, onde o movimento é controlado por meio da proteína de cisteína de conjugação de fluoróforos extracelularmente aplicadas, a inserção de proteínas fluorescentes codificados geneticamente, ou a incorporação de aminoácidos não naturais na região de interesse ^1. Esta informação adicional produz informação cinética sobre rearranjos conformacionais dependentes de voltagem da proteína através de alterações no microambiente em torno da molécula fluorescente.

Introduction

Técnicas de fixação de tensão especializados permitir a gravação de correntes iônicas de potenciais de membrana controladas. Amplamente utilizado braçadeira de tensão de dois eletrodos (TEVC) e técnicas de patch clamp fornecer informações eletrofisiológico confiável sobre as propriedades de muitos canais iônicos. No entanto, ambos os métodos têm desvantagens que impedem a obtenção de dados confiáveis ​​para os canais de sódio dependentes da voltagem rápidos e outros canais de ativação rápida nas membranas, como as de oócitos de Xenopus. Os laboratórios Bezanilla e Stefani, consequentemente, desenvolveu a técnica lacuna vaselina braçadeira de tensão cut-abert....

Protocol

1. Configuração do equipamento inicial

1. Coloque o palco eo manipulador de microeletrodos em um sistema de vibração de isolamento (por exemplo, uma mesa de ar) com uma gaiola de Faraday circundante, para evitar o ruído elétrico e mecânico.
2. Solda seis pelotas Ag / AgCl para comprimentos de 24 AWG de seis polegadas. Para um desses comprimentos (para ser ligado a P1), tala num segundo fio de modo a formar um "Y". Nas extremidades de cada fio de soldar um pino BNC ouro, que está.......

Discussion

A vaselina oócito tensão lacuna técnica braçadeira cut-aberto permite a resolução rápida de dados, baixo ruído, maior controle sobre a solução interna e composição da solução externa e gravações estáveis ​​através de protocolos relativamente longos ^19. Estas vantagens definir esta técnica além de o grampo de voltagem de dois eléctrodos padrão e técnicas de fixação de membranas. Apesar de equipamento especializado é necessária e que o protocolo é relativamente difícil, muito po.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.