<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

Summary

Kesik açık vazelin boşluk yaklaşım hızlı kanal kinetiği yüksek çözünürlüklü Xenopus oositlerde eksprese edilen voltaj-bağımlı iyon kanallarının iyonik ve yolluk akımlarının düşük ses kayıtları elde etmek için kullanılır. Küçük değişiklikler ile, voltaj kıskaç fluorometri kesme açık oosit protokolüne akuple edilebilir.

Abstract

Kesik açık oosit Vaseline boşluk (COVG) voltaj kelepçe tekniği oositlerde heterolog iyon kanalları, elektrofizyolojik ve kinetik özelliklerinin analizi sağlar. Kesim açık kurulumdan Kayıtlar düşük büyüklüğü yolluk akımları, hızlı iyonik akım aktivasyonu ve deaktivasyonunu çözmek için özellikle yararlıdır. Iki elektrotlu voltaj kelepçe (TEVC) tekniği fazla temel faydaları artış kelepçe hızı, gelişmiş bir sinyal-gürültü oranı ve hücre içi ve hücre dışı ortamı ayarlama yeteneği de bulunmaktadır.

Burada, kesme açık setup ve protokol hem de voltaj kelepçe fluorometri özelliği eklemek için gerekli olan değişiklikleri göstermek için, (HNA _V 1.5), Xenopus oositlerde eksprese edilen insan kardiyak sodyum kanalı kullanır.

Böyle HNA _V 1.5 gibi hızlı aktive iyon kanalları, özellikleri, tam olarak hangi de, TEVC kullanılarak oda sıcaklığına yakın çözülemezoosit membran saat tamamı voltaj kontrolü zorlaştırır, kenetlenir. Bununla birlikte, kesme, açık teknik, hücre zarının sadece küçük bir kısmının izolasyon patch clamp teknikleriyle ilişkili kanal halsiz önlerken doğru hızlı kinetiği kaydetmek için gerekli olan hızlı bir sıkma sağlar.

COVG teknik, iyon kanalı kinetik ve elektrofizyolojik özellikleri ile bağlantılı olarak daha fazla protein, hücre dışı hareket uygulanır fluoroforlar, genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri sokulması, ya da doğal olmayan amino asitlerin dahil sistein konjügasyonu ile izlenen voltaj kelepçe fluorometri kullanılarak deneye tabi tutulabilir ilgi ^1'in bölgesine. Bu, ek veri flüoresan molekülü çevreleyen mikro-değişimlere ile proteinin voltaj bağımlı konformasyonel yeniden düzenlemeleri ile ilgili kinetik bilgi verir.

Introduction

Uzman voltaj kenetleme teknikleri, kontrol edilen membran potansiyelleri iyonik akımların kayıt izin verir. Yaygın iki elektrotlu voltaj kelepçe (TEVC) kullanılmış ve yama kelepçe teknikleri çok iyon kanallarının özellikleri hakkında güvenilir elektrofizyolojik bilgi sağlar. Ancak, bu yöntemlerin her ikisi de hızlı voltaj-kapılı sodyum kanalları ve bu tür Xenopus oosit gibi zarlarında diğer hızlı aktive kanallar için güvenilir verilerin ele geçirilmesini önlemek dezavantajları var. Bezanilla ve Stefani laboratuvarları dolayısıyla oosit ² için kesim açık Vazelin boşluk gerilim kelepçe tekniği (COVG) geliştirdi. Bu teknik, Na ^+, K ^+<....

Protocol

1.. İlk Ekipman Kurulumu

1. Elektrik ve mekanik gürültüyü önlemek için çevredeki Faraday kafesi olan bir titreşim izolasyon sistemi (örneğin bir hava tablo) sahne ve mikroelektrod manipülatör yerleştirin.
2. 24 AWG tel altı-inç uzunluklarda altı Ag / AgCl pelet lehimleyin. Bu uzunlukları biri için (P1 bağlanabilir), bir ikinci tel birleşme yeri bir "Y" oluşturulur. Her kablonun ucunda amplifikatör ile birlikte bir altın BNC pimi, lehim.
3. Banyo / Muhafız.......

Discussion

Kesim açık oosit Vazelin boşluk gerilim kelepçe tekniği hızlı veri çözünürlüğü sağlar, düşük gürültü, nispeten uzun protokolleri üzerinden ¹⁹ iç çözümü ve dış çözüm kompozisyon üzerinde kontrol ve istikrarlı kayıtları arttı. Bu avantajlar, ayrı Standart iki elektrotlu voltaj kelepçe ve yama kelepçe teknikleri bu teknik ayarlayın. Özel ekipman gerekli ve protokol nispeten zor olmasına rağmen, sistem optimize edildikten sonra, çok az sayıda sorunlar oluşur. Bu sody.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.