È riportato un metodo di quantificazione neutrofili. Questo metodo crea un ambiente di flusso dinamico simile a quello riscontrato in un vaso sanguigno. Permette la ricerca di neutrofili adesione a entrambi le molecole purificate di adesione (ligando) o substrato di cellule endoteliali (HUVEC) in un contesto simile all'ambiente in vivo con lo stress puro.
Ferma neutrofili alle cellule endoteliali svolge un ruolo critico nel processo infiammatorio sia in salute e malattia. Il processo di adesione dei neutrofili dell'impresa coinvolge molte molecole di adesione tra cui membri della famiglia delle integrine β 2 e le loro contro-recettori della famiglia ICAM. Recentemente, naturalmente varianti genetiche sia β 2 integrine e ICAM sono segnalati per essere associati con la malattia autoimmune. Così, la capacità adesiva quantitativa dei neutrofili da individui con diverse forme alleliche di queste molecole di adesione è importante studiare rispetto a meccanismi alla base dello sviluppo di autoimmunità. Studi adesione a sistemi camera di flusso possono creare un ambiente con sollecitazione di taglio fluido simile a quello osservato nell'ambiente vaso sanguigno in vivo. Qui, presentiamo un metodo che utilizza un sistema di dosaggio camera di flusso per studiare le proprietà adesive quantitativi di neutrofili nel sangue periferico umanos di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e di substrati ligando purificati. Con questo metodo, le capacità adesive neutrofili da donatori con diverse varianti alleliche in recettori di adesione possono essere valutati e confrontati. Questo metodo può anche essere modificato per valutare l'adesione di altri tipi di cellule primarie o linee cellulari.
Varianti genetiche in entrambi i β 2 integrine e ligandi in ICAM ora sono riconosciuti per essere associato con lo sviluppo della malattia autoimmune 1,2. La determinazione delle conseguenze funzionali di queste varianti in cellule derivate da individui con queste varianti è necessario per la nostra comprensione di come queste varianti contribuiscono alla patogenesi della malattia autoimmune. Tali studi funzionali consentono la determinazione dei meccanismi attraverso i quali naturalmente varianti genetiche modellano la risposta immunitaria nella salute e nella malattia. Nell'esempio specifico del LES, ora sappiamo che le varianti in ITGAM (CD11b) e il suo ligando, ICAM-1, fortemente associamo con lo sviluppo della malattia di 1,2. Perché neutrofili sono fondamentali nelle risposte infiammatorie, lo studio quantitativo dei neutrofili può fornire approfondimenti meccanicistici sul modo in cui le varianti genetiche in ITGAM / ICAM alterano l'infiammazione.
NeutropHIL ferma adesione alle cellule endoteliali (EC) è un processo altamente regolato e svolge un ruolo fondamentale nella risposta infiammatoria 3,4. La ferma adesione di neutrofili segue rotolamento dei neutrofili iniziale e la cattura alla CE e, infine, può portare a trasmigrazione in vivo. Questi processi coinvolgono diversi tipi di molecole di adesione, incluse ICAM-1, ICAM-2, P-selectina, E-selectina sulle cellule endoteliali e β 2 integrine sulla neutrofili 5-9. Così, attenta quantificazione dei neutrofili da donatori con diverse varianti alleliche delle molecole di adesione sarà importante per capire le conseguenze funzionali e patologiche di queste varianti genetiche.
Sperimentazione di una camera di flusso in grado di creare un ambiente in vitro con sollecitazione di taglio fluido simile a quello osservato nell'ambiente vaso sanguigno in vivo 10-12. Infatti, un saggio camera di flusso accoppiato con umbili umanacal cellule endoteliali della vena (HUVEC) può simulare l'ambiente in vivo di un vaso sanguigno. Usando questo metodo, si possono studiare le proprietà adesive cellulari complessive verso cellule endoteliali. Inoltre, l'ambiente altamente controllato della camera di flusso consente anche la valutazione della cella legame ai ligandi adesione purificate come ICAM-1 per facilitare lo studio di interazioni recettore-ligando specifico.
Vi presentiamo qui un metodo che utilizza un sistema di test di adesione camera di flusso per studiare le proprietà adesive dei neutrofili nel sangue periferico umano di HUVEC e ai substrati ligando purificati. Utilizzando questo metodo con cellule di donatori che esprimono diverse varianti alleliche molecola di adesione ci permette di valutare come queste varianti genetiche possono alterare impresa neutrofili umana adesione.
Tutti i donatori reclutati per questo studio hanno dato il consenso informato scritto e lo studio è stato approvato dalla University of Alabama a Birmingham Institutional Review Board.
1. HUVEC Cultura iniziale e Subculture
2. Preparazione HUVEC Strato
3. Purificata Ligand Coating
4. Separazione dei neutrofili (Tutti i passi eseguiti a temperatura ambiente)
5. Flusso Camera Adesione saggio
Esempi di neutrofili legame di un ligando purificato (ICAM-1/P-Selectin) camera di flusso rivestito (Figura 2) o di legarsi ad un HUVEC rivestite saggio camera di flusso (figura 3) neutrofili sono mostrati. Come mostrato nelle figure, neutrofili continuano ad accumularsi / aderire alla superficie rivestita o HUVEC in condizioni di flusso continuo. Nelle nostre condizioni sperimentali tipiche, possiamo osservare 50-70 neutrofili umani saldamente aderenti alla superficie rivestita o HUVEC durante un periodo di registrazione di quattro minuti. Tuttavia, le varianti alleliche delle molecole di adesione dei neutrofili, o le varianti alleliche del substrato (ligando purificato o HUVEC), potrebbero alterare sostanzialmente quantitativa neutrofili 14.
Abbiamo anche valutato la dipendenza temporale degli eventi di adesione dei neutrofili osservati nei nostri studi. Mentre stiamo mantenendo condizioni di flusso costante, è possibile che le proprietà adesive delle cellule cambiano nel tempo. Huttavia, negli relativamente brevi corsi di tempo nei nostri studi, non osserviamo differenze consistenti nel tasso di adesione nel corso del tempo. Ad esempio, valutare l'adesione ai 1-2 punti temporali minuti rispetto alla adesione osservata tra i 3-4 numero minimo di punti di tempo non sono sempre diversi. Naturalmente, se le cellule vengono stimolate durante l'esperimento adesione, poi cambiamenti nelle proprietà adesive nel tempo si poteva aspettare.
Nei nostri studi, abbiamo controllato per isolare l'attivazione dei neutrofili indotta intenzionalmente priming delle cellule con una bassa dose di fMLP (10 -8 M) per 10 minuti prima dell'inizio dello studio. Le cellule endoteliali (HUVEC nei nostri studi) richiedono l'attivazione prima di aumentare l'espressione delle molecole di adesione per una ottimale ferma adesione dei leucociti. In assenza di pre-trattamento, le cellule endoteliali (HUVEC) sosterranno pochissimo adesione dei neutrofili. Nei nostri studi, abbiamo usato 10 ng / ml trattamento TNFa per 4-6 ore prima dell'uso. IL-1β (10 ng / ml) e LPS (0,5-1 mg / ml) può essere usato per pre-attivare le cellule endoteliali. Importante, greggia HUVEC può essere utilizzato come controllo negativo per garantire che l'adesione delle cellule è causata da specifiche interazioni cellulari neutrofili-endoteliale (recettore-mediata). In alternativa, anticorpi anti-recettore possono essere usati per bloccare i recettori specifici per valutare la specificità di aderenza.
Figura 1. Configurazione della camera di flusso sul palco microscopio. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Scatti Figura 2 schermo da un video di esempio di neutrofili che aderiscono alla ICAM-1/P-Selectin superficie rivestita in diversi momenti (A:. 0 punto di tempo, B: 1 punto min Tempo, C: 2 punti min di tempo, e D: 4 min punto di tempo). La concentrazione di ICAM-1 è 25 mg / ml e P-selectina è di 0,5 mg / ml. Velocità del flusso dei neutrofili è di 350 ml / min, con densità di neutrofili a 500.000 cellule / ml.
Figura 3 colpi di schermo da un video di esempio di neutrofili che aderiscono alla superficie HUVEC rivestita in diversi momenti (A: 0 punti di tempo, B: 1 min punto di tempo, C: 2 punti di min di tempo, e D: 4 min punto di tempo)..Velocità del flusso dei neutrofili è di 350 ml / ml con densità neutrofili 500.000 cellule / ml.
Specie | Posizione | Shear stress (dyne / cm 2) |
Umano | Arteria caroid Comune | 11.6 |
Umano | Dell'arteria branchiale | 6.5 |
Umano | Arteria femorale comune | 4.3 |
Umano | Aorta surrenale | 7.3 |
Umano | Aorta Supraceliac | 4.2 |
Umano | Superficiale arteria fermoral | 4.4 |
Umano | Venule | 0,5-5,0 |
Umano | Retina prima arteriole | 40.2 |
Umano | Secondo arteriole della retina | 0.001 |
Umano | Retina prima venule | 23.2 |
Umano | Secondo venule retiniche | 0.43 |
Cane | Arteria caroid Comune | 15.8 |
Coniglio | Arteria caroid Comune | 23.3 |
Ratto | Arteria caroid Comune | 46.6 |
Mouse | Arteria caroid Comune | 64.8 |
Cane | Arteria femorale comune | 9.8 |
Coniglio | Arteria femorale comune | 156.8 |
Ratto | Arteria femorale comune | 65.9 |
Tabella 1. Esempio di shear stress nei diversi organi e specie diverse.
* Riassunte dai riferimenti 13, 16, 19, e 20.
Questo protocollo guida la separazione e l'isolamento dei neutrofili minimamente attivati per l'accurata quantificazione di neutrofili in condizioni di stress puro. Neutrofili è un processo critico nell'infiammazione. Poiché varianti genetiche in molecole multiple di questo processo hanno dimostrato di predisporre allo sviluppo della malattia autoimmune 1,2, è necessario un sistema di test in grado di valutare quantitativamente ditta neutrofili umani adesione. Il metodo descritto in questo protocollo consente la determinazione accurata e quantitativa del potenziale adesivo compatto di neutrofili in un ambiente controllato in vitro sotto stress pura. Questo metodo consente quindi il confronto diretto di adesione dei neutrofili quantitativa tra individui genotipizzati per determinare l'importanza della variazione genetica in molecole di adesione 14.
Diversi passaggi di questo metodo meritano attenta considerazione per ragRisultati e altamente quantitativi e riproducibili. Nella preparazione HUVEC, è fondamentale per raggiungere il 100% di confluenza cella prima di utilizzarle nella camera di flusso. Per l'utilizzo di superfici rivestite con ligando purificato, l'area di rivestimento substrato deve mai essere lasciata asciugare per evitare la denaturazione del legante. Inoltre, la preparazione dei neutrofili umani è fondamentale per il successo dell'esperimento. Questioni chiave isolare neutrofili dal sangue includere manipolazione delicatamente minimizzando vortex per evitare l'attivazione, mantenendo le cellule a temperatura ambiente (cioè il sangue non dovrebbe essere memorizzato su ghiaccio e centrifugazione procedura deve essere eseguita a temperatura ambiente) e completando l'isolamento e l'esperimento nel minor tempo possibile. Ci sono altri metodi di isolamento dei neutrofili che possono anche essere utilizzati per preparare le cellule per questi saggi 17,18.
Da un punto di vista pratico saggi, di adesione con appena isolate neutrofili umani deve essere iniziato entro 3-6 ore dopo partecipante salasso. Come neutrofili sono estremamente sensibili alla manipolazione, tempi prolungati tra il prelievo di sangue e il loro utilizzo potrebbe influenzare i risultati del test. Determinazione accurata di concentrazione cellulare neutrofili prima del test camera di flusso è anche necessario per ottenere risultati accurati e riproducibili.
Durante il test camera di flusso, è importante monitorare attentamente la registrazione video per garantire che la velocità di flusso è costante e non c'è turbolenza per tutta la durata dell'esperimento. Le variazioni di velocità di flusso o la presenza di turbolenze richiedano che l'esperimento ripetuto. Dopo l'esperimento, è anche importante valutare le rimanenti neutrofili microscopicamente per garantire che i neutrofili non sono grumi. Aggregazione a questo punto indicherebbe che i neutrofili sono diventati attivato che potrebbero alterare significativamente la densità neutrofili durante l'esperimento.
contenuto "> La camera di flusso crea una tensione in prossimità omogenea pura all'interno della camera (τ = 6Qμ / (wh 2), dove Q = portata, μ = viscosità dinamica, e w = larghezza della camera di flusso, h = altezza del flusso camera 15). Nei nostri studi, abbiamo utilizzato una portata di 350 ml / min per neutrofili, che crea uno stress pura di 1,5 dyne / cm 2 (w = 0.25 cm, h = 0,01 pollici, la viscosità dell'acqua a 37 ° C (0,007 poise) è stato utilizzato come approssimazione della viscosità RMPI media). Per una camera di flusso specifico, si può modificare la portata per ottenere diversi livelli di stress pura per simulare diverse condizioni fisiologiche. Tipica shear stress fisiologico in vasi sanguigni umani possono intervalli tra 0.5-5.0 dyne / cm 13,16. sollecitazioni di taglio in altri vasi sanguigni e altri animali sono stati elencati nella Tabella 1 113,16,19 20.Mentre il nostro metodo si è concentrato sullo studio dell'adesione delle neutrophi umanals, questo metodo non è limitato a neutrofili e può essere facilmente applicato ad adesione o studi rotolamento di altri tipi di cellule con semplici modifiche. Inoltre, i substrati di questo metodo possono essere modificati per scopi diversi.
Sebbene questo protocollo è facilmente adattabile a diversi studi, ci sono alcune limitazioni. Il protocollo attuato qui richiede grande numero di cellule primarie per l'analisi. Questo può precludere l'analisi di pile di piccoli animali. Inoltre, la necessità di immobilizzare ligandi adesione purificati in una conformazione attiva / disponibili possono limitare la gamma di ligandi. L'uso delle proteine di fusione Fc-migliora notevolmente le possibilità di ottenere una corretta conformazione ligando sulla superficie della lastra. Tuttavia, il metodo ha una notevole flessibilità per consentire l'analisi quantitativa di eventi di adesione. Questi studi permettono di migliorare notevolmente la nostra comprensione di coppie recettore-ligando adesione, e l'importanza potenziale funzione di varianti genetichein queste proteine, nella patogenesi di malattie umane.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è sponsorizzato dal Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 e NIH UL1-TR00165. Ringraziamo il Dott. Robert P. Kimberly per il suo continuo sostegno.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table of Reagents Materials | |||
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
2X Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
35mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
75cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35mm dishes |
fMLP | Sigma | 47729 | |
Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy ficoll |
HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
ICAM-1 | R&D systems | 720-IC | Fc chimera |
Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light ficoll |
Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-Glutamine and Phenol Red |
Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
P-Selectin | R&D systems | 137-PS | Fc chimera |
Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
TNF-a | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
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