Abstract
Engineering
Toezicht op de dynamiek van protonatie en eiwithoofdketen conformatie veranderingen tijdens de functie van een eiwit is een essentiële stap om het mechanisme. Protonering en conformationele veranderingen de vibratie patroon van aminozuurzijketens en de peptidebinding, respectievelijk, die beide kunnen worden gesondeerd door infrarood (IR) spectroscopie verschil. Voor eiwitten waarvan de functie kan herhaaldelijk en reproduceerbaar veroorzaakt zijn door het licht, is het mogelijk om infrarood verschil spectra te verkrijgen met (sub) microseconde resolutie over een breed spectraal bereik met behulp van de stap-scan Fourier transform infrarood techniek. Met ~ 10 2 -10 3 herhalingen van de fotoreactie, het minimum aantal om een scan tegen redelijke spectrale resolutie en bandbreedte te voltooien, kan het geluidsniveau in de absorptie verschil spectra zo laag zijn als ~ 10-4, voldoende om de kinetiek van volgen protonering wordt van een enkel aminozuur. Lagergeluidsniveaus worden bereikt door meer gegevens middelen en / of wiskundige bewerking. De hoeveelheid eiwit vereist voor optimale resultaten is tussen 5-100 ug, afhankelijk van de sampling techniek. Wat aanvullende eisen, moet het eiwit eerst worden geconcentreerd in een lage ionensterkte buffer en vervolgens gedroogd om een film te vormen. De eiwit film wordt gehydrateerd voorafgaand aan het experiment, hetzij kleine druppeltjes water of onder gecontroleerde luchtvochtigheid. Het bereikte hydratatie niveau (g water / g eiwit) wordt afgeleid uit een IR-absorptiespectrum. Om de techniek te laten zien, hebben we de fotocyclus van de licht-aangedreven bacteriorhodopsin proton-pomp in zijn native paars membraan milieu, en van de licht-gated ionkanalen channelrhodopsin-2 opgelost in detergent.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved