小鼠皮肤及其毛囊图案和感觉轴突形态分析中的应用平山成像

Summary

哺乳动物的皮肤中含有结构的多样化 - 如毛囊和神经末梢 - 表现出独特的空间组织模式。作为平坦安装分析皮肤借此组织的2维几何的优点，以产生皮肤结构的全厚的高清晰度图像。

Abstract

皮肤是一种高度非均质的组织。真皮内的结构包括毛囊，立毛肌，表皮特殊化（如Merkel细胞簇），皮脂腺，神经和神经末梢和毛细血管。这些结构的空间布置受到严格控制在微观尺度上 - 如看到的那样，例如，在在一个单一的毛囊细胞类型的有序排列 - 和在宏观尺度上 - 所看到的数以千计的头发在几乎相同的方向皮肤的局部区域​​内的毛囊。可视化这些结构而不物理切片的皮肤是因为这个器官的2维几何的可能。在这个协议中，我们证明了小鼠皮肤可解剖，固定，透，染色，明确作为一个完整的二维物体，一台安装。该协议允许对皮肤结构的可视化容易以其全部通过大面积的皮肤被选择的整个厚度iCal的切片和重建。这些结构中的图像也可以与左右位置和相对方位信息集成到主体轴。

Introduction

皮肤是身体中最大的器官，在躯体感觉，绝缘/体温调节和免疫防御¹重要的功能。了解皮肤的发育和功能的细胞和分子基础已经因为皮肤作为一个生物系统及其与皮肤科相关的基本重要性的长期利益。哺乳动物的皮肤中含有多种多细胞结构，包括角质形成细胞分层层，真皮结缔组织，几种类型的毛囊，皮脂腺，立毛肌，血管，至少有十几个不同的类传入的（感觉）和传出神经的纤维（ 图1）。身体的不同区域与典型不同类型的皮肤有关。在大多数哺乳动物中，几乎整个身体表面覆盖有皮肤被密集地填充有毛囊。 [人类和无毛鼹鼠构成例外TH是的图案。头发是从手和脚，这也与专门的表皮图案（皮纹），外分泌腺和感觉神经末梢相关的掌面失踪。控制生长，分化和毛囊内的细胞空间排列的细胞和分子事件是特殊利益，因为每个毛囊展品，缩影，很多器官²的主要特征。这些功能包括干细胞的存在和干细胞小生境，正是编排细胞迁移，并从胚胎学上不同的部分多细胞结构的组装。

本文介绍了解剖方法，固定，标记和成像小鼠皮肤作为一个完整的二维表，被称为“整装”或“平山”的准备。自小鼠的皮肤较薄，也能够通过图像扁平的滑雪板的整个厚度N使用常规的共聚焦显微镜。平板安装的方法来成像哺乳动物皮肤在技术上是有利的，因为它绕过了需要物理切片，从而使结构将完全由光学切片重建。因为几乎整个皮肤被处理为一个单一的对象，平面安装方法也有利于身体表面的多个区域的成像，同时保持对位置和相对方位信息到主体轴。最后，对皮肤内的....

Protocol

严格按照本指南中的美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用的建议进行研究。所有的动物都按照批准的机构动物护理和使用委员会的约翰霍普金斯医疗机构（IACUC）协议MO11M29处理。咨询安乐死的方法核定的当地机构动物护理和使用委员会的指导方针。处理醛固色剂或有机溶剂时，应戴上手套，实验室外套，和护目镜。

材料1。准备

1. 浇SYLGARD板
   1. 按照制造商的指示.......

Discussion

上述的解剖方法的掌握，只需要耐心，一个稳定的手，和几个不错的清扫工具。背部皮肤剥离是相对容易的，但尾巴和脚的皮肤解剖 - 尤其是在出生后早期的年龄 - 是更具挑战性。在早期产前年龄（ 例如 ，E15之前），皮肤，很难不将其撕破删除。方便的是，对于生长和皮肤结构小鼠构图的很多研究中，感兴趣的事件发生时出生后，如在立毛肌¹⁹的生长的研究可见，例如。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP)	Roche	11383221001
AM1-43	Biotium	70024
AM4-65	Biotium	70039
Benzyl alcohol	Sigma	402834
Benzyl benzoate	Sigma	B-6630
Confocal microscope	Zeiss	LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody	Sigma	C6198	1:400
Cytokeratin-8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I-c	1:500
Dissecting microscope
Dissection tools	Fine Science Tools		scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G	EM Sciences	17984-25
Formalin	Sigma	HT501320
Glass dishes	Pyrex		6 cm and 10 cm diameter
Glass plates	Amersham Biosciences	SE202P-10	10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover	Nair
Horizontal rotating platform	Hoefer	PR250 Orbital shaker
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Ketamine/xylazine	Sigma	K113
Nitroblue tetrazolium (NBT)	Roche	11383213001
Oil Red O	Sigma	O0625
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Razor Blades	VWR	55411-055
Secondary antibodies	Invitrogen		Alexa-dye conjugated
Sylgard-184	Fisher Scientific	NC9020938
Tissue culture plastic dishes			10 cm diameter
Tissue culture plates			6- and 12-well