Quick Fluorescent

Ved at kombinere RNA fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) med immunofluorescens (immuno-FISH) skaber en teknik, der kan være ansat på enkelt celle niveau til sporing af rumlig dynamik RNA lokalisering med samtidig indsigt i lokalisering af proteiner, epigenetiske modifikationer og andre detaljer der kan fremhæves ved immunfluorescens. X-kromosom inaktivering er et paradigme for lang ikke-kodende RNA (lncRNA) -medieret gendæmpning. X-inaktiv specifik udskrift (Xist) lncRNA akkumulering (kaldet en Xist sky) på en af ​​de to X-kromosomer i hunner pattedyr er et afgørende skridt til at indlede X-kromosom inaktivering. Xist RNA direkte eller indirekte interagerer med forskellige kromatin-modificerende enzymer og indfører forskellige epigenetiske landskaber til det inaktive X-kromosom (Xi). En kendt epigenetisk kendetegnende for Xi er histon H3 trimethyl-lysin 27 (H3K27me3) ændring. Her beskriver vi en enkel og hurtig immuno-FISHProtokol til påvisning Xist RNA ved hjælp af RNA FISH med flere oligonucleotidsonder kombineret med immunfluorescens af H3K27me3 at undersøge lokalisering af Xist RNA og tilknyttede epigenetiske modifikationer. Anvendelse af oligonukleotidprober resulterer i en kortere inkubationstid og mere følsom detektion af Xist RNA sammenlignet med in vitro transskriberede RNA-prober (riboprober). Denne protokol giver et stærkt redskab til at forstå dynamikken i lncRNAs og de tilhørende epigenetisk modifikation, chromatinstruktur, nuklear organisation og transkriptionel regulering.