Snel Fluorescent

Combineren RNA fluorescente in situ hybridisatie (FISH) met immunofluorescentie (immuno-FISH) maakt een techniek die kan worden toegepast bij de enkele cel niveau om de ruimtelijke dynamiek van RNA lokalisatie met gelijktijdige inzicht detecteren in de lokalisatie van eiwitten, epigenetische veranderingen en andere details die kan worden benadrukt door immunofluorescentie. X-chromosoom inactivatie is een paradigma voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) gemedieerde silencing. X-inactief specifieke transcript (Xist) lncRNA accumulatie (genoemd Xist cloud) op één van de twee X-chromosomen in zoogdiercellen vrouwen is een kritieke stap voor X-chromosoom inactivatie initiëren. Xist RNA direct of indirect in wisselwerking met diverse chromatine-modificerende enzymen en introduceert verschillende epigenetische landschappen tot het inactieve X-chromosoom (Xi). Een bekende epigenetische kenmerk van de Xi is de histon H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) wijziging. Hier wordt een eenvoudige en snelle immuno-FISH beschrijven weprotocol voor het opsporen Xist RNA met behulp van RNA FISH met meerdere oligonucleotidenprobes combinatie met immunofluorescentie van H3K27me3 om de lokalisatie van Xist RNA en bijbehorende epigenetische veranderingen te onderzoeken. Met oligonucleotide probes resulteert in een kortere incubatietijd en gevoeligere detectie van Xist RNA vergeleken met in vitro getranscribeerd RNA probes (riboprobes). Dit protocol biedt een krachtige tool voor het begrijpen van de dynamiek van lncRNAs en de bijbehorende epigenetische modificatie, chromatine structuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie.