Veloce fluorescente

Combinando RNA ibridazione in situ fluorescente (FISH) con immunofluorescenza (immuno-FISH) crea una tecnica che può essere impiegata a livello di singola cellula per rilevare la dinamica spaziale della localizzazione RNA con visione simultanea nella localizzazione delle proteine, modificazioni epigenetiche e altri dettagli che può essere evidenziato mediante immunofluorescenza. Inattivazione del cromosoma X è un paradigma per lungo RNA non codificante (lncRNA) mediata silenziamento genico. Trascrizione specifico (Xist) accumulo lncRNA X-inattiva (chiamato nuvola Xist) su uno dei due cromosomi X nelle femmine di mammifero è un passo fondamentale per avviare l'inattivazione del cromosoma X. Xist RNA direttamente o indirettamente interagisce con vari enzimi che modificano la cromatina e introduce distinti paesaggi epigenetici alla inattiva cromosoma X (Xi). Una nota caratteristica epigenetica del Xi è l'istone H3 trimetil-lisina 27 (H3K27me3) modifica. Qui, descriviamo un immuno-FISH semplice e veloceprotocollo per la rilevazione Xist RNA utilizzando RNA FISH con sonde multiple oligonucleotide accoppiato con immunofluorescenza di H3K27me3 per esaminare la localizzazione di Xist RNA e modificazioni epigenetiche associate. Utilizzando sonde oligonucleotidiche risultati in un tempo di incubazione più breve e la rilevazione più sensibile di Xist RNA rispetto alle sonde di RNA trascritto in vitro (ribosonde). Questo protocollo fornisce un potente strumento per comprendere le dinamiche di lncRNAs e la sua modificazione epigenetica associato, la struttura della cromatina, l'organizzazione nucleare e regolazione trascrizionale.