Hurtig Fluorescent

Kombinere RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) med immunfluorescens (immun-FISH) skaper en teknikk som kan brukes på celle nivå for å oppdage de romlige dynamikken i RNA lokalisering med samtidig innsikt i lokalisering av proteiner, epigenetiske modifikasjoner og andre detaljer som kan bli markert ved immunfluorescens. X-kromosom inaktivering er et paradigme for lang ikke-kodende RNA (lncRNA) -mediert genet Slå. X-inaktive spesifikk transkripsjon (Xist) lncRNA akkumulering (kalt en Xist sky) på en av de to X-kromosomer i pattedyr kvinner er et kritisk punkt for å starte X-kromosom inaktivering. Xist RNA direkte eller indirekte samhandler med ulike kromatin modifiserende enzymer og introduserer forskjellige epigenetiske landskap til den inaktive X-kromosom (Xi). En kjent epigenetisk kjennetegn på Xi er Histone H3 trimetyl-lysin 27 (H3K27me3) modifikasjon. Her beskriver vi en enkel og rask immun-FISHprotokoll for påvisning Xist RNA bruker RNA FISH med flere oligonukleotidprober kombinert med immunfluorescens av H3K27me3 å undersøke lokalisering av Xist RNA og tilhørende epigenetiske modifikasjoner. Ved å bruke oligonukleotidprober resulterer i en kortere inkuberingstid og mer følsom påvisning av Xist RNA sammenlignet med in vitro-transkriberte RNA-prober (riboprober). Denne protokollen gir et kraftig verktøy for å forstå dynamikken i lncRNAs og dens tilhørende epigenetisk modifikasjon, kromatinstruktur, kjernekraft organisasjon og transkripsjonsregulering.