Fluorescent Rápida

Combinando ARN hibridização in situ fluorescente (FISH) com a imunofluorescência (imuno-FISH) cria uma técnica que pode ser empregue no nível da célula individual para detectar a dinâmica espacial de localização de ARN com visão simultânea para a localização de proteínas, modificações epigenética e outros detalhes que pode ser destacado por imunofluorescência. Inativação do cromossomo X é um paradigma para longo RNA não-codificante (lncRNA) silenciamento gênico mediado. Transcrição específico (Xist) acumulação lncRNA X-inactiva (chamado uma nuvem Xist) em um dos dois X-cromossomas em fêmeas de mamíferos é um passo crítico para iniciar a inactivação do cromossoma X. RNA Xist direta ou indiretamente interage com várias enzimas modificadoras da cromatina e introduz paisagens epigenéticas distintas para os inactivos cromossomo X (Xi). Uma característica conhecida da epigenética Xi representa a histona H3 trimetil-lisina 27 modificação (H3K27me3). Aqui, descrevemos um imuno-FISH simples e rápidaprotocolo para a detecção Xist RNA usando RNA FISH com várias sondas de oligonucleotídeos juntamente com imunofluorescência de H3K27me3 para examinar a localização dos Xist RNA e modificações epigenéticas associadas. Usando sondas oligonucleotídicas resulta em um tempo de incubação mais curto e de detecção mais sensível do Xist ARN em comparação com in vitro transcritos de sondas de ARN (ribossondas). Este protocolo fornece uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica de lncRNAs e sua modificação epigenética associados, estrutura da cromatina, organização nuclear e de regulação da transcrição.