Fluorescente Rápida

La combinación de ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) con inmunofluorescencia (inmuno-FISH) crea una técnica que se puede emplear en el nivel de células individuales para detectar la dinámica espacial de la localización del ARN con la penetración simultánea en la localización de las proteínas, las modificaciones epigenéticas y otros detalles que puede ser resaltado mediante inmunofluorescencia. Inactivación del cromosoma X es un paradigma para largo ARN no codificante (lncRNA) mediada por silenciamiento génico. Transcripción específico (Xist) la acumulación lncRNA-X inactivo (llamado una nube de Xist) sobre uno de los dos cromosomas X en las hembras de mamíferos es un paso crítico para iniciar X-inactivación del cromosoma. ARN Xist interactúa directamente o indirectamente con diversas enzimas de la cromatina modificar y presenta distintos paisajes epigenéticos al cromosoma X inactivo (Xi). Una conocida seña de identidad de la epigenética Xi es la histona H3 trimetil-lisina 27 (H3K27me3) modificación. A continuación, describimos una forma sencilla y rápida inmuno-FISHProtocolo para la detección de Xist ARN utilizando ARN FISH con múltiples sondas de oligonucleótidos junto con inmunofluorescencia de H3K27me3 a examinar la localización de Xist ARN y modificaciones epigenéticas asociadas. El uso de sondas de oligonucleótidos resultados en un tiempo de incubación más corto y la detección más sensible de Xist ARN en comparación con el transcrito in vitro sondas de ARN (ribosondas). Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para la comprensión de la dinámica de lncRNAs y su modificación epigenética asociada, la estructura de la cromatina, organización nuclear y la regulación transcripcional.