Snabb Fluorescerande

Kombinera RNA fluorescent in situ hybridisering (FISH) med immunofluorescens (immun FISH) skapar en teknik som kan användas vid enstaka cellnivå för att upptäcka de rumsliga dynamiken i RNA lokalisering med samtidig insikt i lokalisering av proteiner, epigenetiska modifieringar och andra detaljer vilket kan belysas genom immunofluorescens. X-kromosom inaktive är ett paradigm för lång icke-kodande RNA (lncRNA) medierad geners uttryck. X-inaktiv specifika transkript (Xist) lncRNA ackumulation (kallas Xist moln) på en av de två X-kromosomer i däggdjurs honor är ett kritiskt steg för att initiera X-kromosom inaktive. Xist RNA direkt eller indirekt interagerar med olika kromatin-modifierande enzymer och introducerar distinkta epigenetiska landskap till den inaktiva X-kromosomen (Xi). En känd epigenetiska kännetecken för Xi är Histon H3 trimetyl-lysin 27 (H3K27me3) modifiering. Här beskriver vi en enkel och snabb immun FISHprotokoll för att upptäcka Xist RNA använder RNA FISH med flera oligonukleotidprober kombination med immunofluorescens av H3K27me3 att undersöka lokalisering av Xist RNA och tillhörande epigenetiska förändringar. Användning av oligonukleotidsonder resulterar i en kortare inkubationstid och känsligare detektion av Xist-RNA jämfört med in vitro transkriberade RNA-prober (riboprober). Protokollet ger ett kraftfullt verktyg för att förstå dynamiken i lncRNAs och dess tillhörande epigenetisk modifiering, kromatinstruktur, kärnkraft organisation och transkriptionsreglering.