神经肌肉接头处：测量突触大小，碎片和改变突触蛋白密度利用共聚焦荧光显微镜

摘要

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

摘要

神经肌肉接头（NMJ）为大，胆碱能突触继电器通过哺乳动物运动神经元控制随意肌收缩。结构变化在NMJ可导致神经传导故障，导致无力，萎缩，甚至死亡的肌纤维。许多研究已经调查了遗传修饰或疾病如何改变鼠标NMJ的结构。不幸的是，它可以是难以直接从这些研究中，因为他们经常使用不同的参数和分析方法比较结果。三个协议描述。第一种使用最大强度投影共焦图象以测量乙酰胆碱受体（AChR的）的区域富含突触后膜结构域在端板和突触小泡染色上覆突触前神经末端的区域。所述第二协议进行比较的免疫染色在突触后膜突触蛋白的相对强度。第三公关otocol使用荧光共振能量转移（FRET）来检测改变突触后乙酰胆碱受体的终板包装。该协议已经制定和完善了一系列的研究。影响的质量和结果的一致性的因素进行了讨论，并提供了用于在健康的年轻成年小鼠NMJs标准数据。

引言

神经肌肉接头（NMJ）是临界中继突触介导的神经系统和骨骼肌之间的通信。它是必需的所有随意运动。荧光显微镜长期以来被用于研究转基因的作用，对小鼠NMJ ^1-3或之上啮齿类NMJs ^4-11进行比较的年龄，饮食，运动和疾病的影响。这样的研究已经告诉我们很多关于NMJ的生理与病理生理学，但不同的参数报告（ 如，乙酰胆碱受体区，终板面积，周长，碎片指数）往往让人很难比较这些研究结果。有越来越多的期望的临床前研究人员能够证明再现性，特别是与疾病¹²的啮齿动物模型的研究。这里描述的方案通过一系列的研究，研究的发展，生理和病理CH进行了细化安格斯的NMJ。这样的研究需要突触专业的鼠标运动终板的面积和突触蛋白的填料的突触后特^13-15内的相对密度的测定。

这些方法的效用是由最近的研究中的抗麝香重症肌无力的小鼠模型中示出。 IgG抗体从抗麝香阳性重症每日注射肌无力患者到成年小鼠造成他们2周¹⁶内变弱。肌肉切片是被双重标示突触（神经 - 终端）和突触后乙酰胆碱受体共聚焦最大投影图像揭示了乙酰胆碱受体染色作为主要变化领域逐渐下降。下降重要率为足以解释可比下降突触电位，突触传递和肌肉无力^17,18的故障的幅度。定性类似的发现报告了其他研究小组^10,19。同样NMJ测量方法，至今已用于评估治疗抗麝香重症三种药物的影响肌无力这种小鼠模....

研究方案

注：动物实验的设计，实施和报告应采取的现行准则²⁴账户。这样的工作必须由当地动物福利机构（在我们的例子悉尼大学的动物伦理委员会）事先批准。

1.安乐死的动物和肌肉的解剖

1. 传送鼠标从保持室以一个单独的房间，其中它被安乐死与腹膜内注射戊巴比妥溶液 ​​（30毫克/千克）使用由清水²⁵详述的小鼠的处理方式。将鼠标放回笼子。
2. 一旦鼠标的呼吸停止时间超过1分钟，由轻轻刷洗角膜轻轻捏脚，角膜反射测试脚撤回反射。只有当反射性反应是可以缺席鼠标来解剖准备。
3. 咨询啮齿动物解剖这样的图谱作为Chiasson ²⁶和/或寻求experien的帮助试图感兴趣的肌肉解剖前CED解剖学家。在每种情况下使用小的电动剃须刀打开皮肤暴露肌肉之前，从上覆皮肤去除毛发。
   注：夹层将各不相同解剖分明的肌肉。
4. 使用钝钳摆脱覆膜和周围组织肌肉。把握和削减远端肌腱肌肉从其插入分开。
5. 轻轻的挑逗，并剪断不受周围组织马上回原点的肌肉。简要地放置新解剖肌肉成的0.1M磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液或林格氏液之前进一步处理。

2.准备肌肉的Cryosectioning

注：最佳结构保存可以通过整体动物灌注可以实现在可选步骤2.1描述为前面介绍^27，或浸泡固定（对于....

结果

突触面积的测量在NMJ

区域的任何估计依赖的边界的绘制时以限定突触专业化的程度。在健康的年轻成年肌肉NMJ图像应显示良好定义的边界为乙酰胆碱受体和突触素染色（ 图2A和B）。荧光强度为乙酰胆碱受体和突触素在电机板（ 图5A'和B'）的周围突触和突触部之间的边界处急剧上升。对于这样的图像的最小阈值（正上?.......

讨论

这里所述的协议，使我们能够可靠地测量和在一系列条件，包括正常的老化和疾病状态量化变化NMJ的属性。用于连接所描述的方法面临NMJ图像将允许研究来比较前和突触后专业领域和突触重叠和/对齐的区域。比较前和突触后的蛋白质的第二协议，它使用横向光学切片的相对强度，是优选的。第三个协议专门用于测试的变化乙酰胆碱受体的包装在突触后膜的接近。

特异性控制?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Scanning confocal microscope	Leica	DM IRE2 with  TCS SP2 system	Most scanning confocal microscopes should be suitable.
	Zeiss	LSM 510 Meta
	Leica	SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT)	Life technologies	B35451	Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT)	Life technologies	B35450	Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece
rabbit anti-synaptophysin	Life technologies	18-0130	Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234	Milipore	FCMAB134F	Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG	Jackson	711-095-152	Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.)	ProSciTech	IA018	Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO	Sigma	10981	Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors