胆管结扎小鼠：感应炎性肝损伤和纤维化的阻塞性胆汁淤积

Summary

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Abstract

在大多数脊椎动物中，肝脏产生胆汁所必需的乳化吸收的脂肪和使脂质在小肠中的消化以及排泄胆红素和其他代谢产物。在肝脏中，实验梗阻肝外胆道系统的启动病态事件的复杂级联，导致胆汁淤积和炎症导致强烈的纤维化反应从门静脉周围字段始发。因此，胆总管结扎手术已成为最常用的模型来诱导啮齿类动物阻塞性胆汁淤积损伤，并研究背后诱导不适当胆汁流量这些病理生理机制的分子和细胞事件。近年来，不同的外科技术已经描述，要么允许重新连接或再吻合胆管结扎（BDL）之后， 例如 ，局部的BDL，或其它显微方法具体的研究问题。然而，最常用的模型是胆总管诱导后21至28天强烈的纤维化反应的完全阻塞。死亡率会很高因感染并发症或技术错误。在这里，我们提供了详细的手术过程为BDL模型小鼠诱导按照到3R规则动物福利由罗素和伯奇在1959年假设一个高度重复性的纤维化反应。

Introduction

肝纤维化被定义为过量产生和细胞外基质（ECM）的积累源自基质产生肝星状细胞的相互作用的复杂网络和各种肝脏驻留和浸润细胞的血细胞^1,2。虽然肝纤维化可通过多种不同的刺激而引起底层纤维化的分子机制一般都非常相似。下面的肝损害，分子和细胞的变化高度精心策划的程序启动。在这个程序中炎症信号，单核/巨噬细胞和肝星状细胞之间的密切互动发生，在最终结果中的星状细胞的活化和转分化为肌成纤维细胞，细胞外基质沉积和连续的解剖和功能改变的肝组织的完整性^3。肝星状细胞的活化是特别由炎症信号和相互作用与肝从动巨噬细胞的住宅（ 即枯否细胞）。病原体相关分子模式是由专门的模式识别受体识别，如Toll样受体，当通过触发大量的炎性细胞因子和趋化因子驱动的炎性过程³中的表达和分泌的不同途径的复杂网络激活信号。当疾病产生因素被消除的炎症反应，所形成的肝损伤只是暂时的。与此相反，如果损伤仍然存在，肝脏和在导致正常肝实质由瘢痕组织形成渐进取代前景中的表达和ECM观众的堆积内的慢性炎症的发展。

由于在人类肝纤维化是一个世界性的临床问题，已在过去几十年建立的急性和慢性肝衰竭几种实验啮齿动物模型。在万亩海相系统，例如，共同模式是多种不同的肝毒素的施用，胆总管结扎，诱导免疫介导的肝损伤，并且有针对性地引入基因缺陷或转基因的，反之亦然的过度影响临界信令涉及肝纤维化⁴的发病机制的途径。

在啮齿类动物的胆总管结扎已经进行了作为实验过程中研究了很多年^5-8。现在已经提出了超过三十年前⁹第一高度重复性的协议延长胆管结扎（BDL）在啮齿动物。在该协议中双方插管/梗阻和结扎诱导高产肝硬化大鼠与具有可比性的那些人胆汁性肝硬化⁹观察形态变化。各自的协议是简单，在外科手术过程是相当快地适用和动物的存活率是高的超过95％。在经典大鼠插管/梗阻协议，2厘米的短切口，略低于剑突。此后，套管被插入到胆管的近端部和固定在其与丝缝线的位置。在下一步骤中，套管的远侧部分被遮挡用3节，通过中线切口的下端在右下腹⁹把埋皮下。底，腹部被关闭，动物被允许恢复。在结扎协议，将大鼠经受胆总管双重结扎具有或不具有所述连字⁹之间的胆管解剖。

该实验模型被广泛接受，并广泛应用于全球数百个实验室诱导肝胆汁淤积和纤维化。它诱导的肝内胆管上皮细胞的增殖，肌纤维母细胞differentiatioÑ ​​门户成纤维细胞的增殖周围胆管上皮细胞，导致细胞外基质^10,11的高度重现，大规模表达和沉积。因此，这种模式在大鼠和小鼠中的应用正在被科学家，旨在了解肝脏炎症和纤维化的发病机理中流行。

在我们的实验室，我们已经广泛使用该协议在过去的大鼠在几个实验研究，旨在探讨肝纤维化的特殊的分子和细胞方面，并测试新型抗肝纤维化概念和药物^12-15。

最近，我们采用了这种方法，以鼠系统，发现胆管结扎手术也是一个有吸引力的平均成立时间依赖性纤维化低的变化和死亡率在小鼠^16-18。由于动物的更小的尺寸，然而，对于麻醉的一些重要的修改，外科一位软件ention和后处理的观察是必要的，以获得可靠的和可再现的结果在该模型中。完全自适应概括在以下方案和所附的视频文档。

Protocol

注：所有实验均经国家官方动物护理和使用委员会（LANUV，雷克林豪森，德国）。老鼠是根据联邦实验动物科学协会（FELASA）的指引，安置特定病原体的条件下。所有实验均符合有关动物保护和“指南实验动物的护理和使用”（卫生出版^第 8版全国学院，2011年），德国联邦法律进行。

1.术前准备

注：执行干净的，但在非无菌条件下的所有程序。这是用来进行手术的所有仪器等可重复使用的设备，如手术钳，剪刀和科利柏拉钩必须根据是在严格遵守与动物进行手术的机构准则的协议，使用前消毒。;对于必需的试剂，材料和设备的详细清单，请参考具体的材料/设备的列表。

1. 在完成实验，整体保持在加温板的动物在温度为37℃，永久地连接到一个麻醉系统，并且盖的操作区域与不透液性，自粘窗帘。妥善安排所有的仪器及那些在实验过程中，手术前使用的解决方案（ 图1）。
2. 麻醉小鼠吸入在100％的氧气4体积％异氟烷以4升/分钟的麻醉诱导的流速。麻醉的深度足以以下重要标准达到时：定期自主呼吸，疼痛刺激脚趾间的设置后无反射，并且疼痛没有反应。
3. 刮胡子鼠标的腹部的皮毛用电动剃须刀的皮草，保护眼睛免受干燥了的眼睛和正使用OSE软膏。
4. 放置在鼠标上的37℃下加热的热板，插入鼠标吻在Fluovac麻醉系统的Fluovac掩模，并固定动物的腿部用丝绸带的条纹。
5. 维持小鼠通过吸入在100％的氧气1.5-3体积％异氟烷的麻醉以1升/分钟的流速，并通过腹腔注射丁丙诺啡溶液（0.1毫克/公斤体重溶解在0.9％NaCl溶液）导入围手术期的镇痛。
6. 消毒剃腹部皮肤与湿润与标准的防腐剂，准备用酒精溶液手术前的治疗皮肤的纱布拭。注意：在我们的协议，我们使用一种多元醇皮肤antisepticum。这是完全按照有关动物保护和联邦的实验动物科学协会的指导原则德国联邦法律。这种防腐剂含有70％（V / V）2-丙醇，丁1,3.diol和喹啉的痕迹黄色和perfum即

2.外科手术

1. 通过切割表皮加上筋膜同时用11.5厘米外科剪刀打开用的约2厘米的长度的中线剖腹腹部。
2. 通过使用剪刀作为吊具解剖上腹膜顶部的结缔组织。
3. 切开腹膜沿白线，打开腹腔。
4. 通过在胸骨插入夹持缝合，提高缝线的丝，并在Fluovac掩模的顶部将其固定放大空腔。
5. 通过插入一个科利柏牵开器在腹膜腔（ 图2）传播的操作区域。
6. 解除用湿润（0.9％NaCl溶液）棉签肝脏，使得它的腹部侧粘到隔膜和脐是清晰可见的。
7. 露出胆管由肠道（ 图3）的尾部运动。
8. 仔细分离从胆管侧翼门静脉和肝动脉用微型细齿钳（图4A）。
9. 周围放置胆管5-0缝合并用两个手术结固定。当捆扎结连续增加的牵引力，以确保有效梗阻无需切断胆管（ 图4B）。
10. 添加第二颅结扎以相同的方式，但不解剖中（ 图4C）之间的胆管。否则，存在着相当大的风险，胆漏，如果一个结是不安全的，而动物没有经验，但胆汁淤积形成严重的腹膜炎。
11. 切开缝合（ 图4D）的两端，降低胸骨，然后取出牵引器。
12. 冲洗腹腔用0.9％NaCl溶液和替换腹部器官的生理位置。
13. 关闭两个腹部层（腹膜和表皮加上仪表板）具有独立运行的缝线用6-0 Mersilk。
14. 切电子商务缝线的NDS和消毒用纱布蘸拭用消毒液的操作区域。
    注：当第一次执行的手术，在16X-20X的放大倍数进行手术显微镜下的所有程序。这允许更好的识别胆管和清楚地从门静脉和肝动脉（ 图5和6）的区别所在。一些实验室建议在这两个之间结扎胆管的解剖。离开胆管完好因为在结中的一个潜在的泄漏会导致严重的急性腹膜炎，腹水，和全身内毒素血症时胆管解剖。

3，术后治疗和随访

1. 让鼠标在热身通过红外线灯笼子里恢复，直到鼠标完全清醒和活跃。
2. 随后，将鼠标移动到一个正常的笼子，并提供自由采食获得水和食物。
3. 一压脚提升的手术，监测动物以规则的时间间隔，并进行后续的术后治疗与合适的镇痛（ 例如 ，丁丙诺啡溶液）后的内部动物护理的本地建议和使用委员会。
   注：3天进行镇痛治疗。任何异常行为可能表明罕见的并发症，如腹膜炎，败血症或内脏出血，应处理为人类的端点终止实验。
4. 动物保持有自由获取食物和水随意直至实验结束。没有必要对采血因为正在进行的纤维形成用黄疸表示。
5. 当动物被处死，收集血液用于临床化学参数（AST，ALT，胆红素等 ）和肝脏中检索用于组织化学和生物化学分析的测定。

Discussion

胆汁淤积性肝损伤是主要的致病因素为肝纤维化和肝硬化的慢性肝病的发展中的一个。基于这样的事实，这些疾病产生无法估计的医疗保健费用，这是可以理解的，许多研究人员试图了解正在进行肝纤维化的发病机制。因此，实验模型已生成的模拟，导致肝脏炎症，纤维化和肝硬化¹的复杂机制的各个方面。

外科BDL]是用于诱导小鼠和大鼠^4,23,24阻塞性胆汁淤积损伤最普遍的实验模型中的一个。在大多数的协议，将动物麻醉并一个中间段剖腹被执行。接着，胆管，从腹腔发现并使用外科麻线结扎两次。其结果是，在小鼠和大鼠接受本手术ðevelop强烈的纤维化反应，在首先从汇管区²⁵场起源。年期间几个不同的外科技术和修改已被描述。特别程序甚至允许重新连接或再吻合术BDL ²³后。其他技术是基于局部BDL导致显著少坏死形成并因此肝细胞增殖^24。部分BDL在随后切除胆囊（胆囊切除术）相结合，防止胆囊炎的形成也代表了一个极好的实验模型急性胆汁淤积。有人提议是一个模型，更接近人类的情况^24。事实上，建立这种模式的过程中，它已经表明，它重复导致只有很少的病理组织损伤胆汁淤积，不进行慢性胆汁淤积^25。因此，有人提出，这种模式是理想的学习纬度逆转胆汁淤积²⁴电子商务的影响。甚至更复杂的方法是基于显微并允许快速且可重复的方式，以仅在肝中²⁶的选定部分造成胆汁性肝损伤。

虽然从最初的BDL协议这些复杂的改型已被证明在调查的特定研究问题非常有益的，许多实验室全世界基本上瞄准采用BDL模型作为胆汁淤积性纤维化重复性，可靠性高的模型。然而，许多并发症可以发生，可以显着地改变了由该模型得到的，如果技术错误都不能避免的结果的可重复性和可靠性。例如，出血有关的伴随胆管血管损伤的并发症（ 见图3 - 4）可以期间或手术后迅速发生。随后心脏抑制或r过量麻醉espiratory失败也是程序可以避免的并发症。严重的感染，从腹膜炎败血症，在实验的整个期间，可能会发生，如果缝线不正确地进行和胆汁泄漏到腹腔。意外伤害的肠道手术过程中也可能会导致腹膜炎。因此，很明显，这是符合严格操作准则标准化协议强烈要求。这一规定也于近日欧盟，其在2013年¹实施新的动物福利规则的国家内的要求。与此相关的规定各自的要求是不是新的，并已经提出在1959年，当罗素和伯奇认为道德框架进行的，主要是基于更换，细化和还原（3R）原则上²⁷动物科学实验。

继outlin当ED的协议有可能产生的技术错误只有少数并发症。可能发生的，而低频三个具体问题。

如同所有的外科手术，麻醉剂的过量是危险的动物特别是在与低​​温组合的潜在来源。如果在手术过程中的心血管并发症发生，麻醉剂的供给，应立即停止，并且操作者应尽量提供尽可能氧气鼠标。这可以通过被填充有空气和泵入受损动物的嘴的小塑料注射器的手段来完成。可替代地，使用小Peleusball为受影响动物的通风是振兴过程中经常有帮助的。

在伤口愈合的问题

在BDL手术后，老鼠会咬自己的痛处接缝或其他动物。如果出现这种情况，各小鼠应分别关不住的。动物与开放性伤口应麻醉，伤口周围的区域轻轻消毒用标准的防腐剂，而应伤口被缝了起来。在接下来的3天里，这些动物的伤口应定期检查（一天两到三倍）。

腹部或腹水形成的次膨胀是指示为细菌感染。这些可能发生由于在手术过程中未消毒的工作。所有类型的感染应无例外处理的人性化的终点，应该被牺牲的动物受到影响。

我们提供了一个易于遵循协议，允许BDL的小鼠的表现是实现简单并且唤起只有低动物死亡率结合具有高再现性。所有的手术方案可以通过熟练的科学家迅速抓获。在完成实验，将动物保持在一个加温板，在3​​7℃和永久地连接到麻醉系统，减少疼痛和痛苦。对于手术，腹部被打开了中线剖腹手术和胆管双重结扎不解剖它。这里讨论的代表性结果证明，表型改变对于肝脏形态（炎症，纤维化，肝硬化）是高度可再现的，并允许研究纤维化的不同方面（ 例如 ，起始，炎症，进展，终末期疾病）在定义的时间点。

我们希望，我们的协议的总结将有助于缩短学习曲线是必要的成功建立在其他实验室这一纤维化模型，并保证在不同地点可靠和可重复的结果。因此我们认为，所提出的协议支持的3R原则，即在1959年应该由拉塞尔和Burch和代表的是在许多国家无线当前实施的新的动物福利规则的基础薄的欧洲框架。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Shaver Favorita II	Aeskulap	GT104
Cutter head	Aeskulap	GT730
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Warming plate and controller	Labotect	HP 062
Fluovac anesthesia system	Harvard Apparatus	34-1030
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser	Eickemeyer	4802885
Scotch Tape	commercially available
Tissue paper	commercially available
Durapore silk tape	3M	1538-1
Cotton Gauze swabs	Fuhrmann GmbH	32014
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum	Antiseptica GmbH	72PAH200
Raucodrape OR adhesive drapes	Lohmann & Rauscher GmbH	33013
Scissor	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Graefe forceps straight	Fine Science Tools Inc.	11050-10
6-0 Mersilk suture	Ethicon	K889H	Silk, non-absorbable/Abdominal closure
Needle holder Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Colibri retractor	Fine Science Tools Inc.	17000-03
Cotton swabs	Noba Verbandmittel	974202
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1032238
25mL beaker	Schott Duran	50-1150
Isotonic (0.9%) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Micro-serrations forceps Moria MC31	Fine Science Tools Inc.	11370-31	Bile duct separation
5-0 Mersilene suture	Ethicon	EH6731H	Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation
5mL syringe	BD Discardit II	300296
1mL syringe	BD Plastipak	300013
Sterican needle 26 G x 1	B. Braun	4657683
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00	Analgeticum, 0.1 mg/kg
Infrared lamp	Petra Electric	IR 11