Generering Primær fibroblastkulturer fra museøre og hale Væv

Summary

Vi beskriver en enkel og hurtig eksperimentelle procedure til generering af primære fibroblaster fra ørerne og haler af mus. Proceduren kræver ikke særlig dyretræningssystem og kan anvendes til generering af fibroblastkulturer fra ører opbevaret ved stuetemperatur i op til 10 dage.

Abstract

Primære celler er afledt direkte fra væv og menes at være mere repræsentativ for den fysiologiske tilstand af celler in vivo end etablerede cellelinjer. Men primære cellekulturer har normalt en begrænset levetid og skal ofte genetableres. Fibroblaster er en let tilgængelig kilde til primære celler. Her diskuterer vi en enkel og hurtig eksperimentelle procedure for at etablere primære fibroblastkulturer fra ører og haler af mus. Protokollen kan bruges til at etablere primære fibroblastkulturer fra ører opbevaret ved stuetemperatur i op til 10 dage. Når protokollen er omhyggeligt fulgt, er usandsynlig på trods af anvendelsen af ​​ikke-sterilt væv opbevares i længere tid i nogle tilfælde forureninger. Fibroblaster formere sig hurtigt i kultur og kan udvides til et betydeligt antal før de undergik replikativ senescens.

Introduction

Primære celler er afledt af levende væv og dyrkes under in vitro betingelser. Det er almindeligt antaget, at primære celler mere ligner fysiologiske tilstand og den genetiske baggrund af det væv, hvorfra de stammer end udødeliggjorte eller tumorcellelinier ^1. Af denne grund udgør primære celler en nyttig model til undersøgelse af biologiske spørgsmål ^2,3. Men i modsætning til etablerede cellelinjer, der vokser i det uendelige, primære celler til sidst undergår ældning i kultur og skal ofte genetableres.

Almindeligt anvendte primære celler indbefatter fibroblaster, epitelceller, endotelceller, T-celler, B-cel....

Protocol

Musene blev opstaldet i patogenfrie betingelser i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier indtil euthanization (Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer på National University of Singapore og det nationale rådgivende udvalg for Laboratory Animal Research (NACLAR) retningslinjer).

1. Mus

1. Bestil en mus af den passende genetisk baggrund. Denne protokol er baseret på væv afledt fra en C57BL / 6 mus.

2. Fremstilling af komplet mediu.......

Discussion

Her giver vi en enkel, billig og hurtig eksperimentelle procedure for at etablere primære fibroblastkulturer fra ører og haler af mus. Ekstraktionen bør resultere i adhærente og hurtigt delende fibroblaster inden for 3 dage efter isolering af vævet. En vigtig begrænsning af primærelementer er degeneration, en permanent vækst anholdelse ^15. Under anvendelse af protokollen, kan fibroblastkulturer passeres i 5 til 6 gange før fibroblaster bliver aldrende, angivet ved udfladning af celler, vokse i størr.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG