Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Summary

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Abstract

Primärzellen werden direkt aus Gewebe gewonnen und sind gedacht, um mehr repräsentativ für den physiologischen Zustand der Zellen, die in vivo als etablierte Zelllinien sein. Jedoch weisen primäre Zellkulturen in der Regel eine begrenzte Lebensdauer und häufig wiedereingeführt werden müssen. Fibroblasten sind eine leicht zugängliche Quelle von Primärzellen. Hier diskutieren wir eine einfache und schnelle Versuchsdurchführung zu primären Fibroblastenkulturen von Ohren und Schwanz von Mäusen zu etablieren. Das Protokoll kann die primäre Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden, zu etablieren. Wenn das Protokoll genau befolgt, sind Verunreinigungen unwahrscheinlich, trotz der Verwendung für längere Zeit in einigen Fällen nicht gespeichert unsterilen Gewebe auftreten. Fibroblasten vermehren sich rasch in Kultur und kann zu einer beträchtlichen Zahl vor einer replikativen Seneszenz erweitert werden.

Introduction

Primärzellen werden von lebendem Gewebe und kultiviert unter in vitro Bedingungen abgeleitet sind. Es wird allgemein angenommen, dass primäre Zellen, die den physiologischen Zustand und der genetische Hintergrund des Gewebes, aus dem sie stammen, als immortalisierte oder Tumorzelllinien ¹ stärker ähneln. Aus diesem Grund Primärzellen sind ein nützliches Modell für die Untersuchung biologischer Fragestellungen ^2,3. Doch im Gegensatz zu etablierten Zelllinien, die auf unbestimmte Zeit zu wachsen, Primärzellen schließlich unterziehen Seneszenz in Kultur und häufig wiedereingeführt werden müssen.

Üblicherweise v....

Protocol

Die Mäuse wurden in pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts bis Euthanasie (The Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien an der National University of Singapore und der National Advisory Committee für Labortierforschung (NACLAR) Richtlinien) untergebracht ist.

1. Mäuse

1. Bestellen Sie eine Maus der entsprechenden genetischen Hintergrund. Dieses Protokoll basiert auf Gewebe von einer C57BL / 6-Mäusen abgeleitet wurden.

Discussion

Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige und schnelle experimentelle Verfahren zur primären Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse zu etablieren. Die Extraktion sollte in haftende und sich schnell teilenden Fibroblasten innerhalb von 3 Tagen nach der Trennung des Gewebes führen. Eine wichtige Einschränkung von Primärzellen ist Seneszenz, eine dauerhafte Wachstumsstillstand ^15. Verwendung des Protokolls kann Fibroblastenkulturen für 5-6 mal passagiert werden, bevor Fibroblasten.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG