Culturas de geração primária de fibroblastos de rato orelha e da cauda Tecidos

Summary

Nós descrevemos um procedimento experimental simples e rápida para a geração de fibroblastos primários dos ouvidos e caudas de camundongos. O processo não requer a formação especial animal e pode ser utilizado para a geração de culturas de fibroblastos de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias.

Abstract

As células primárias são derivadas directamente a partir de tecidos e pensa-se ser mais representativo do estado fisiológico das células in vivo do que as linhas de células estabelecidas. No entanto, as culturas de células primárias geralmente têm um tempo de vida finito e precisa de ser frequentemente restabelecida. Os fibroblastos são uma fonte facilmente acessível de células primárias. Aqui, discutimos um procedimento experimental simples e rápida para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. O protocolo pode ser utilizado para estabelecer culturas de fibroblastos primários de espigas de armazenados à temperatura ambiente durante até 10 dias. Quando o protocolo seguido é cuidadosamente, as contaminações não são susceptíveis de ocorrer, apesar da utilização de tecido não-estéril armazenada por tempo prolongado, em alguns casos. Os fibroblastos proliferam rapidamente em cultura e pode ser expandido para um número substancial antes de se submeter a senescência replicativa.

Introduction

As células primárias são derivadas a partir de tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro. Geralmente assume-se que as células primárias mais se assemelham ao estado fisiológico e o fundo genético do tecido a partir do qual foram produzidos de linhas de células imortalizadas ou de tumor ^1. Por essa razão, as células primárias representam um modelo útil para o estudo biológico perguntas ^2,3. No entanto, ao contrário de linhas celulares estabelecidas que crescem indefinidamente, células primárias, eventualmente, submetidos a senescência em cultura e têm de ser frequentemente restabelecida.

Células primári....

Protocol

Os ratos foram alojados em condições livres de patógenos em conformidade com as diretrizes institucionais, até a eutanásia (The Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) orientações na Universidade Nacional de Cingapura e do Comité Consultivo Nacional para a Research Laboratory Animal (NACLAR) orientações).

1. Ratos

1. Peça um rato do fundo genético apropriado. Este protocolo baseia-se em tecido derivado de uma C57BL / 6 mouse.

2. Preparação de Meio.......

Discussion

Aqui nós fornecemos um procedimento experimental simples, barato e rápido para estabelecer culturas de fibroblastos primários de orelhas e rabos de ratos. A extracção deve resultar em fibroblastos aderentes dividem rapidamente e dentro de 3 dias após o isolamento do tecido. Uma importante limitação de pilhas é senescência, uma parada do crescimento permanente ^15. Usando o protocolo, culturas de fibroblastos podem ser passadas durante 5 a 6 vezes antes de se tornar fibroblastos senescentes, indicado .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG