Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

Summary

Опишем простой и быстрый экспериментальную процедуру для генерации первичных фибробластов из ушей и хвостов мышей. Процедура не требует специальной подготовки животных и может быть использован для генерации фибробластов культур от ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней.

Abstract

Первичные клетки получают непосредственно из тканей и, как считается, более представительным физиологического состояния клеток в естественных условиях, чем установленные клеточных линий. Тем не менее, первичных клеточных культур, как правило, имеют конечный срок службы, и их необходимо часто восстановлена. Фибробласты легко доступным источником первичных клеток. Здесь мы обсудим простой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Протокол может быть использован для установления первичных культур фибробластов из ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней. Когда протокол внимательно следил, загрязнения, вряд ли произойдет, несмотря на использование нестерильных ткани хранится в течение длительного времени в некоторых случаях. Фибробласты быстро размножаются в культуре и может быть расширена до значительного числа перед прохождением репликативной старение.

Introduction

Первичные клетки получают из живой ткани, и культивируют при условиях в пробирке. Это, как правило, предполагается, что первичные клетки больше напоминают физиологическое состояние и генетический фон ткани, из которой они возникли, чем иммортализованных или опухолевых клеточных линий ^1. По этой причине, первичные клетки представляют собой полезную модель для изучения биологического вопросы ^2,3. Однако, в отличие установленных клеточных линий, которые растут на неопределенный срок, в конце концов, первичные клетки претерпевают старение в культуре, и необходимо часто восстановлена.

Обычно используемые первичны....

Protocol

Мышей содержали в свободных от патогенов условиях в соответствии с институциональными принципов вплоть до euthanization (институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) руководящих принципов в Национальном университете Сингапура и Национального консультативного комитета лабораторн?.......

Discussion

Здесь мы предлагаем простой, недорогой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Извлечение должно привести к адгезивных и быстро делящихся фибробластах в течение 3 дней после выделения ткани. Важным ограничением.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG