Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

Summary

Se describe un procedimiento experimental sencillo y rápido para la generación de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El procedimiento no requiere una formación especial de los animales y se puede utilizar para la generación de cultivos de fibroblastos de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días.

Abstract

Las células primarias se derivan directamente de tejidos y se cree que son más representativa del estado fisiológico de las células in vivo que las líneas celulares establecidas. Sin embargo, cultivos de células primarias por lo general tienen una vida finita y deben ser restablecido con frecuencia. Los fibroblastos son una fuente fácilmente accesible de células primarias. En este caso, hablamos de un procedimiento experimental simple y rápida para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El protocolo puede ser utilizado para establecer cultivos de fibroblastos primarios de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días. Cuando el protocolo se sigue cuidadosamente, las contaminaciones son poco probable que ocurra a pesar de la utilización de tejido no estéril almacenada por un tiempo prolongado en algunos casos. Los fibroblastos proliferan rápidamente en la cultura y se puede ampliar a un número considerable antes de someterse a la senescencia replicativa.

Introduction

Las células primarias se derivan de tejido y se cultivaron viven bajo condiciones in vitro. Se asume generalmente que las células primarias se asemejan más el estado fisiológico y el fondo genético del tejido del que se derivan de líneas celulares inmortalizadas o tumorales ^1. Por esa razón, las células primarias representan un modelo útil para el estudio de cuestiones biológicas ^2,3. Sin embargo, a diferencia de las líneas celulares establecidas que crecen indefinidamente, células primarias, finalmente, se someten a la senescencia en la cultura y necesitan ser restablecido con frecuencia.

Células primarias ....

Protocol

Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos en el cumplimiento de las directrices institucionales hasta la eutanasia (El Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) directrices de la Universidad Nacional de Singapur y el Comité Nacional Asesor para el Laboratorio de Investigación Animal (NACLAR) directrices).

1. Los ratones

1. Ordene un ratón del fondo genético apropiado. Este protocolo se basa en el tejido derivado de un ratón C57BL / 6.

Discussion

Aquí le ofrecemos un procedimiento experimental simple, barato y rápido para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. La extracción debe resultar en fibroblastos en división adherentes y rápidamente dentro de 3 días post-aislamiento del tejido. Una limitación importante de células primarias es la senescencia, una detención del crecimiento permanente ^15. Utilizando el protocolo, cultivos de fibroblastos se pueden pasaron durante 5 a 6 veces antes de fibrobl.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG