Generera Primär fibroblastkulturer från mus Öron och Tail Vävnader

Summary

Vi beskriver en enkel och snabb försöksförfarande för generering av primära fibroblaster från öronen och svansar av möss. Förfarandet kräver ingen speciell djurträning och kan användas för generering av fibroblastkulturer från öronen som lagrats vid rumstemperatur under upp till 10 dagar.

Abstract

Primärceller härrör direkt från vävnad och tros vara mer representativ för den fysiologiska tillstånd av celler in vivo än etablerade cellinjer. Men primära cellkulturer har oftast en begränsad livslängd och måste ofta återinföras. Fibroblaster är en lättillgänglig källa av galvaniska element. Här diskuterar vi ett enkelt och snabbt experimentella förfarande för att fastställa primära fibroblastkulturer från öron och svansar av möss. Protokollet kan användas för att etablera primära fibroblastkulturer från öronen lagrade vid RT under upp till 10 dagar. När protokollet följs noggrant, är osannolika trots användningen av icke-steril vävnad lagras under längre tid i vissa fall föroreningar. Fibroblaster förökar sig snabbt i kultur och kan utökas till betydande antal innan de genomgick replika åldrande.

Introduction

Primära celler härrör från levande vävnad och odlas under in vitro betingelser. Det antas allmänt att primära celler liknar närmare det fysiologiska tillståndet och genetisk bakgrund av den vävnad från vilken de härrör än odödliga eller tumörcellinjer ^1. Av den anledningen, galvaniska element utgör en användbar modell för att studera biologiska frågor ^2,3. Men till skillnad från etablerade cellinjer som växer på obestämd tid, primära celler genomgå småningom åldrande i kultur och måste ofta återinföras.

Vanligen använda primära celler innefattar fibroblaster, epitelceller, endotelceller, T-celler, B-celler, ....

Protocol

Möss inhystes i patogenfria förhållanden i enlighet med de institutionella riktlinjerna tills eutanasi (Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer vid National University of Singapore och den nationella rådgivande kommittén för försöksdjurs Research (NACLAR) riktlinjer).

1. Möss

1. Beställa en mus av den lämpliga genetiska bakgrunden. Protokollet är baserat på vävnad härledd från en C57BL / 6-mus.

2. Framställning av Komplett .......

Discussion

Här ger vi en enkel, billig och snabb experimentella förfarande för att fastställa primära fibroblastkulturer från öron och svansar av möss. Extraktionen bör resultera i vidhäftande och snabbt delande fibroblaster inom 3 dagar efter isolering av vävnaden. En viktig begränsning av galvaniska element är åldrande, en permanent tillväxtstopp ^15. Med hjälp av protokollet, kan fibroblastkulturer passerats i 5 till 6 gånger innan fibroblaster blir åldrande, vilket indikeras av en flackare celler, ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Calf Serum	HyClone	SV30160.03
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010
Ethanol	Merck Millipore	107017	Absolute for analysis
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088866001	From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease	Merck Millipore	53702	From Streptomyces griseus
Tris buffer (pH 8)	1st BASE	1415	Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM syringe filter	Sartorius Stedim	16534
70 μM cell strainer	SPL	93070
Syringe plunger	Terumo	SS+10L
Cryovial tube	NUNC	368362
1.7 ml microcentrifuge tube	Axygen	MCT-175-C
10 cm cell culture dish	Greiner	664160	Cell culture treated dish
15 ml conical bottom tube	Greiner	188271
50 ml conical bottom tube	Greiner	227261
Water bath	GFL	1002
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Incubation shaker	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope	Carl Zeiss AG