Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

Abstract

פרוטוקול זה הוא מדריך מעשי N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. מחקרים אחרונים רבים יש לאמת את התועלת של שיטה זו לשיפור שימור עצביים, הכוללת הכדאיות פרוסה של המוח. היישום של טכניקה זו על ידי המוקדמים הנחתה מפורט חקירות תפקוד המוח באמצעות מגוון יישומים ניסיוני, על פני מגוון רחב של בעלי חיים הגילאים, אזורים במוח, ואת סוגי תאים. השלבים הבאים מתוארים שבצעתי שחזור מגן המוח פרוסה הטכניקה באמצעות אופטימיזציה NMDG נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) מדיה ניסוח וההליך משופרת כדי להשיג בצורה אמינה פרוסות המוח בריא עבור תיקון קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה. עם גישה מעודכנת זו, שיפור ניכר הוא ציין את המהירות, אמינות של ג'יגה אוהם לאטום היווצרות במהלך תיקון ממוקד קלאמפ הקלטה ניסויים תוך שמירה על שימור עצביים מעולה, ובכך להקל מאתגר יישומים ניסיוני. התוצאות נציג ניתנים מן המלחציים נוירון רב תיקון רישום ניסויים כדי assay קישוריות סינפטית פרוסות המוח neocortical שהוכנו העכברים הטרנסגניים למבוגרים צעירים, בוגרים מבוגרים דגימות נוירוכירורגיים אנושי. יתר על כן, שיטת שחזור מגן NMDG אופטימיזציה ששיספתי המוח הוא תואם עם חיות הן לנוער והן למבוגרים, ובכך לפתרון מגבלה של המתודולוגיה המקורי. לסיכום, ניתן ליישם על ניסוח מדיה בודד והמוח חותך הליך על פני מינים והגילאים השונים כדי להשיג מעולה לשימור הכדאיות ורקמות.

Introduction

המוח חריפה פרוסה ההכנה היא מערכת חיוניים דגם ניסיוני במדעי המוח. בערך חצי מאה, פלטפורמה זו אפשרה דינמי מחקרים תפקודית של המוח החי על פני מגוון רחב של אזורים במוח האנטומי של מיני בעלי חיים. אם היישום המיועד הוא ביוכימיה, הדמיה תפקודית, מורפולוגיה או אלקטרופיזיולוגיה, זה חשיבות עליונה כדי להבטיח תקינות האופטימלי ואת הכדאיות של הרקמה הפרוס. זה מסיבה זו כי ההכנה פרוסה מדרגית המוח מכרסמים לנוער (קרי, צעיר יותר כמחנכת ליום 30 עכברים) כבר המועדף ביותר עד כה. הקושי בהשגת המוח מספיק בריא פרוסות של מבוגר בוגר, הזדקנות חיות הוכיחה להיות אתגר עצום עבור רוב מטילה מגבלות חמורות ללמוד אדריכלות תפקודית של המוח בוגרת. זה נכון במיוחד עבור תיקון קלאמפ הקלטה, טכניקה דורשת שימור פונקציונלי מורפולוגיים מעולה, היא הכרחית עבור אפיון מפורט ומאפייני מהותי סינפטית של נוירונים יחיד שזוהה. מספר עשורים, הרוב המכריע של תיקון קלאמפ electrophysiologists צריכים לסמוך על שיטת 'מגן חיתוך' באמצעות שהוחלפו סוכרוז נמוך Na+ חנה המבר1 להכנת פרוסות המוח בריא של ילדותי, רחוק במידות שונות במידה אפרוחי למבוגרים. שיטה זו מבוססת על ההנחה כי זרם Na+ פסיבי, הזנת מים הבאים ותא נפיחות במהלך השלב חיתוך פרוסה היא העלבון השולט שמוביל הישרדות המסכן של נוירונים, במיוחד עבור אלה נוירונים הממוקמת שכבות שטחיות שסביר לקיים טראומה ישירה מהתנועה להב. עם זאת, שיטת חיתוך מגן עדיין משאיר רחוק ממשביע להכנה פרוסה מוח מחיות למבוגרים בוגר ללא קשר ניסוח מסוים חנה המבר מיושמת.

פתרון פשוט אך יעיל לבעיה זו היה תיאר2,3,4,5,6 , כינה את השיטה פרוסה של המוח 'שחזור מגן'. הגירסה המקורית של שיטה זו משתמש של NMDG שהוחלפו כלנית חדד, כפי NMDG היה מזוהה ביותר תכליתי ויעיל בקרב שונים אחרים המועמד נתרן יון תחליפים (כולל סוכרוז, גליצרול, כולין, טריס). ניסוח מדיה היה משופרת נוספת על ידי תוספת של HEPES להתנגד המוח פרוסה בצקת ולספק pH חזק יותר באגירת7, וכן התוספת של תוספים כדי לנטרל את השפעות מזיקות של סטרס חמצוני (טבלה 1). מדעית נקבע כי דגירה ההחלמה הראשונית נה נמוך+, נמוך Ca2 +, ולקבל גבוהה מ ג2 + NMDG חנה המבר מיד לאחר בציעת רקמת המוח למבוגרים היה נחוץ וגם מספיק עבור שיפור עצביים שימור על טווח רחב של אזורים במוח, סוגי תאים בעלי חיים גילאי3,5,6.

ראוי לציין, גלגולים קודמות של מה עכשיו שכונתה שיטת שחזור מגן ניתן למצוא את הספרות1,8,9,10,11,12, 13, למרות הפוטנציאל המלא מבוגרים למבוגרים, הזדקנות החייתי במוח פרוסה, תיקון קלאמפ ההקלטה לא הייתה מוכרת או הפגינו בעבודות קודמות אלה. בנוסף, הניואנסים וריאציות פרוצדורלי ממשיכים להגיח לתמיכה יישומים ספציפיים ניסיוני4,14,15,16. הגוף הקולקטיבי של העבודה של קבוצות מחקר רבות אלה מקנה ביטחון מלא ב החוסן של פעולת שחזור מגן לשימור רקמות משופרת. שיטת שחזור מגן NMDG יש עכשיו כבר נרחב אימץ ויושמו תוך ניצול למבוגרים החייתי במוח פרוסה ההכנות מחקרים רבים של מחקר שפורסם. מחקרים אלה חריפה פרוסה span17,neocortical3,18, בהיפוקמפוס15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, המוח האמצעי25,26,27,28,29ו hindbrain30,31,32, 33 , 34 אזורים, ועוד מגוון של סוגי נוירוטרנסמיטר, המודל העצבי כולל4,glutamatergic30, GABAergic18,20,31,35 ,36, דופאמין24,29,37,38,37,שימוש14,38, 39, noradrenergic40, תכולה27,28 עצבית. השיטה מתאימה מאוד גם על השליטה optogenetic פעילות. עצבית פרוסות נגזר מ-3,חיות הטרנסגניים39 או בעקבות ויוו ויראלי זריקות17,27, 28,40,41,42,43, כמו גם פונקציונלית Ca2 + הדמיה של פעילות. עצבית2,44 45, ,46. ניתוחים של טווח קצר פלסטיות4,47,48 וגם צורות מגוונות של לטווח ארוך פלסטיות16,35,48 כבר דיווח. מחקר שנערך לאחרונה החלת שיטת שחזור מגן NMDG כדי להקל על נרחבת ושיטתית חיטוט של קישוריות סינפטית בקליפת הראיה פרוסות המוח בוגרת בעכבר למבוגרים באמצעות octopatch את ההקלטה תצורה49 – רב עוצמה הפגנה של השירות ואת החוסן של שיטה זו. שיטת שחזור מגן אפילו הוחל בהצלחה בהקשרים ניסיוני בעבר בלתי צפויות, כגון, שיפור שימור להערכת pericytes פרוסות המוח קורטיקלית למבוגרים50, מלחציים תיקון הקלטה מ מושתלים interneuron אוכלוסיות בעוד בן 1-1.5 שנה מחלת אלצהיימר העכבר דגמי20, של המוח למבוגרים פרוסה קולטן סחר assay51.

הפרוטוקול הבא מתאר הליכים מפורטים ליישום שיטת שחזור מגן NMDG אופטימיזציה של המוח פרוסה הכנה לשיפור הכדאיות של פרוסות המוח חריפה. העקרונות לשימור עצביים משופרת הנזכרים, כמו גם הדגמה של היתרונות ברורים של מתודולוגיה זו עבור תיקון נוירון רב מורכבים קלאמפ הקלטה ניסויים פרוסות המוח הצעיר העכבר הטרנסגניים למבוגרים והן למבוגר בוגר פרוסות המוח האנושי הנוירוכירורגית. פרוטוקול הבאים אומתה עבור עכברים מן בן 21 ימים בת אחד או יותר, כמו גם לגבי האדם דגימות נוירוכירורגיים נגזר חולים מבוגרים.

Protocol

נהלים הקשורים העכברים הטרנסגניים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) במכון אלן למדעי המוח. עכברים C57BL/6 גם זכר וגם נקבה (טווח משקל 10-30 גר') שימשו בניסויים אלה. חלק מהתוצאות נציג לתאר את הנתונים שנאספו מ פרוסות המוח האנושי חי. דגימות רקמה neocortical התקבלו במהלך neurosurgeries להסרת הגידול. היה צורך להסיר את הרקמה neocortical שמעליה כדי לקבל גישה אל רקמות חולות. החולה והסכמתו מושכלת הושג בכל המקרים לשימוש של רקמות נוירוכירורגיים למטרות מחקר תחת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדי של מרכז רפואי שוודי.

1. הכנת המדיה, ריאגנטים (טבלה 1)

הערה: פתרונות צריכה להיות מורכבת במים מטוהרים ללא תשלום במתכות, זיהומים אחרים. מומלץ כי פתרונות לעשות טרי ביום של הניסוי, למרות פתרונות שאינם בשימוש ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 1 בשבוע, אם רצונך בכך. 1 ליטר של כל ניסוח לעיל מספיקה להליכי עם פרוסות 1 – 2. כל הפתרונות חנה המבר חייב להיות רווי carbogen (95% או2/5% CO2) לפני השימוש כדי להבטיח pH יציב אגירה חמצון נאותה. ה-pH של כל הפתרונות צריך להיות מותאם 7.3-7.4 ו osmolality נמדד, להתאים ל- 300-310 mOsmol/kg.

  1. להכין כלנית חדד NMDG-HEPES (במ מ): 92 NMDG, 2.5 אשלגן כלורי,2פו ' NaH 1.25 '4, 30 NaHCO3, HEPES 20, 25 גלוקוז, thiourea 2, נה 5-ascorbate, נה 3-פירובט, 0.5 CaCl2·2H2O ו- 10 MgSO4·7H2O. Titrate pH ל 7.3 –7.4 17 מ ל + /-0.5 מ ל חומצה הידרוכלורית 5 מ'.
    הערה: שלב זה טיטור אידיאלי להתבצע לפני התוספת של קטיונים דו ערכיים להימנע משקעים; עם זאת, המשקעים יכול להיות הפוך על ההתאמה של ה-pH על הטווח פיזיולוגיים.
  2. להכין HEPES מחזיק כלנית חדד (במ מ): 92 NaCl, 2.5 אשלגן כלורי,2פו ' NaH 1.25 '4, 30 NaHCO3, HEPES 20, 25 גלוקוז, thiourea 2, נה 5-ascorbate, נה 3-פירובט, 2 CaCl2·2H2O ו- 2 MgSO4·7H2Titrate O. ה-pH ל 7.3-7.4 עם מספר טיפות של מרוכזים 10 N NaOH.
  3. הכינו הקלטה כלנית חדד (במ מ): 124 NaCl, 2.5 אשלגן כלורי, NaH 1.252PO4, 24 NaHCO3, גלוקוז 12.5, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O ו- 2 MgSO4·7H2O. Titrate pH ל 7.3-7.4 עם כמה טיפות מרוכז 10 N NaOH.
  4. להכין Na+ ספייק-אין פתרון (ז 2): 580 מ ג של NaCl מומס 5 מ ל שזה עתה הוכנו כלנית חדד NMDG-HEPES. זהו פתרון מספיק להכנה פרוסה אחת במוח.
  5. להכין 2% agarose כדי לשמש להטבעת רקמות. לפזר 2 גר' agarose סוג 1B (ראה טבלה של חומרים) ב- 100 מ של 1 x PBS, מיקרוגל עד רק מרתיח. מערבולת כדי לערבב, ואז שופכים את התערובת לתוך צלחות פטרי סטרילי 10 ס מ מאפשרים לחזק. לאחסן את הצלחת agarose בשקית ניילון אטומה ב 4 ° C עד השימוש.
  6. להכין בזריקות הרדמה עובד פתרון מניות. לערבב 2.5 גר' 2,2,2-Tribromoethanol עם 5 מיליליטר 2-מתיל-2-butanol, ואז לפזר בהדרגה ב- 200 מ ל PBS, pH 7.0-7.3. לסנן את הפתרון מניות עם מסנן מיקרומטר 0.22 לפני השימוש ולאחסן ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    הערה: התייעץ עם הנחיות ועדת המתאימים לשימוש בבעלי חיים וכללים לקביעת תפוגה וסילוק נוהל ההרדמה עובד פתרון מניות.

2. ההתקנה של התחנה עם פרוסות

  1. להגדיר את התחנה עם פרוסות עם רקמת מבצעה המכונה, מכשירי ניתוח (ראה טבלה של חומרים). כדי לכייל את המכונה מבצעה, לצרף להב מזרק קרמיקה זירקוניום הזרוע להב באמצעות דבק מהיר-דבק, ולאחר מכן להוסיף בעל הדגימה וליישר בחוד החנית של הלהב על הדגימה למחזיק החישוק בהשאירכם רווח קטן כדי להבטיח את הלהב לא לגרד המתכת.
    הערה: אם קצה הלהב לא פגום פיזית זה ניתן להשתמש בהם עבור רבים שבועות או אפילו חודשים ללא החלפה. מודלים שונים של מבצעה רקמות זמינים מסחרית, שרבים מהם יכול לספק ביצועים מעולים כאשר מכוילים בצורה אופטימלית. הכלי האידיאלי צריך להיות סטיה ציר z מינימלית, או ישירות נמדד, מכוון או מדעית שנצפו.
  2. להגדיר את גביע 250 מ ל מלא עם 200 מ של NMDG-HEPES חנה המבר ותירגע מראש על הקרח carbogenation קבוע (ליישמם באמצעות מפזר גז אבן שקוע בתוך המדיה) עבור > 10 דקות.
    הערה: פתרון זה ישמש עבור transcardial זלוף, מילוי המאגר מכונת חיתוך במהלך חלוקתה.
  3. הגדרת תא פרוסה המוח הראשונית שחזור מלא 150 מ ל כלנית חדד NMDG-HEPES (לשמור על carbogenation קבועה) ומניחים את התא באמבט מים מחומם ומתוחזק על 32-34 מעלות צלזיוס.
    הערה: תא פרוסה לאחר העיצוב של אדוארדס, Konnerth (1992)52 מומלץ בשלב זה. התאים האלה יכולה להתבצע באמצעות מעבדה זמינים פריטים (גביע 250 מ ל, ניילון mesh רשת, צינור חרוטי 50 מ ל, דיש עגול מפלסטיק 35 מ מ). יש לנקוט על מנת להבטיח כי פרוסה רשת נשאר ללא אוויר בועות, במיוחד אלה ללא הרף המיוצר על ידי האבנים בועות של גז carbogen כמו אלה יכול לגרום פרוסות לצוף למעלה, להתקלקל. הרשת צריכה להיות שקוע בערך 1 ס מ מתחת לפני השטח נוזלי.
  4. להגדיר פרוסה המוח מחזיק לחדר; עיצוב עם מספר בארות עצמאית מאגר גדול יותר מומלץ (ראה טבלה של חומרים). למלא המאגר 450 מ של חנה המבר HEPES וחמים לטמפרטורת החדר תחת carbogenation מתמדת עד השימוש.
    הערה: פרוסות המוח יועבר מן החדר ההחלמה הראשונית לתא הזה לאחסון לטווח ארוך לפני הקלטה אלקטרופיזיולוגיות. יש לנקוט על מנת להבטיח כי השרידים כילות slice ללא בועות אוויר בכל עת.
  5. להכין agarose מותכת להטבעת רקמות. השתמש את הקצה הפתוח של בקבוקון חרוט 50 מ ל כמו חותכן עוגיות כדי לגזור בלוק של 2% agarose מן המנה מוכנה קודם לכן. ברפיון וחוץ את המבחנה חרוט, ולאחר מכן במיקרוגל ל s 10 – 30 עד agarose פשוט נמס. לא לחמם יותר מדי.
  6. שופכים את agarose מותכת לתוך צינורות 1.5 mL. לשמור את agarose במצב מותך באמצעות של thermomixer מוגדר כ- 42 ° C עם טלטול נמרץ. בזהירות להבטיח כי agarose מותך לא לחזק בטרם עת.
  7. מקם את האביזר מצמרר בלוק עבור בפורס בקרח להתקרר מראש בשלב זה.

3. Transcardial זלוף

הערה: ההליך זלוף transcardial היא צעד חשוב בעת עבודה עם חיות למבוגרים, חשוב להשיג קירור מהיר של המוח, האט את המטבוליזם באמצעות אינפוזיה המוח של נה נמוך+, נמוך Ca2 +גבוהה מ ג2 + כלנית חדד פתרון. זלוף transcardial משמש גם כדי לנקות את כדוריות הדם האדומות של המוח להערכת, אשר מפחית autofluorescence שעלולות להפריע ויזואליזציה והיעדים של אוכלוסיות תאים fluorescently עם תוויות שורות הטרנסגניים. . זה לא רצוי להשמיט זלוף transcardial...

  1. עמוק עזים ומתנגד עכברים באמצעות הזרקת בקרום הבטן בפתרון מניות בעבודה הרדמה (250 מ"ג / ק"ג: 0.2 מ"ל של 1.25% הרדמה עובד מניות פתרון לכל 10 גרם משקל הגוף, ראה את הטבלה של חומרים). לאחר ~ 2-3 דק ', ודא מספיק עומק ההרדמה על-ידי הערכת הבוהן קמצוץ רפלקס. אם נדרש, להזריק אחסון נוסף של מניות בעבודה הרדמה, להעריך מחדש הבוהן קמצוץ רפלקס אחרי עוד 2-3 דקות.
  2. לטעון מזרק 30 מ עם 25 מ של carbogenated NMDG-HEPES חנה המבר מ כשהספל טרום מקורר 250 מ ל (2 – 4 ° C הוא אופטימלי, לעומת פתרון ברד או קפוא). צרף מחט מד 25 5/8.
  3. עם העכבר על גבו, להצמיד את forepaws ואת כפות הרגליים האחוריות ליציבות. 15 ס מ זכוכית פטרי מלא עבודות סיליקון מוקשח כמו הבסיס.
  4. באמצעות אזמל, עושים חתך לרוחב כדי לפתוח את חלל בית החזה ברמה של הסרעפת. השתמש בסדר מספריים לחתוך כלוב הצלעות על גם צד מקפיד להימנע מסיכה הלב והריאות.
  5. להצמיד בחזרה את החלק מרכז של כלוב הצלעות לחשוף את הלב. להכניס המחט של מזרק 30 מ ל החדר השמאלי וחותכים אטריום ימין עם מספריים בסדר כדי לאפשר לדם לצאת ללב.
  6. את הבוכנה מזרק באמצעות לחץ קבוע ידנית, perfuse החיה עם חנה המבר צוננת NMDG-HEPES בקצב של ~ 10 mL/min.
    הערה: אם זלוף הוא מוצלח הכבד ישנה בצבע אדום עמוק לצהוב בהיר, ובחלק מן המקרים ברור נוזלים יכול להיות שנצפו יציאה הנחיריים לקראת סוף התהליך.

4. המוח לנתיחה וחלוקת

  1. לערוף את החיה. השתמש באזמל לפתוח את העור על הראש ולחשוף את כובע הגולגולת.
  2. השתמש בסדר סופר-גזור מספריים לחתוך את העור מעל הכיפה הגולגולת ולבצע חתכים קטנים רוחבית משני צדדיו-סימטרית/הגחוני / בסיס הגולגולת. לעשות חתכים נוספים, החל מ- ההיבט סימטרית הגבי של הגולגולת מתקדם בכיוון rostral את האמצע הגבי מטפל שלא יגרמו נזק במוח המשמשת כבסיס. להפוך סופית אל ' ניגש בניצב האמצע ברמה של הנורות הריח.
    הערה: יש לנקוט כדי לוודא שאין נזק עשה את region(s) המוח עניין. בפרט, לא תהיה שום כוח compressive חלה על המוח עצמו.
  3. השתמש המלקחיים עגול-טיפ כדי לתפוס את הגולגולת החל מ- ההיבט rostral המדיאלי ולהתקלף בחזרה לעבר הכיוון סימטרית-צדדי. חזור על שני הצדדים לפצח לפתוח ולהסיר את החצאים הגבי של המכסה הגולגולת כדי לחשוף את המוח. בעדינות ולהוציא המוח בשלמותם לתוך הספל של טרום מקורר כלנית חדד NMDG-HEPES. לאפשר למוח להתקרר בצורה אחידה ~ 1 דקות.
  4. השתמש המרית גדולים כדי להרים את המוח מחוץ כשהספל ולתוך הפטרי מכוסה נייר סינון. לקצץ וחסום את המוח לפי הזווית המועדפת של בציעת והרצוי אזור במוח של עניין. לעבוד מהר כדי למנוע מחסור בחמצן ממושך במהלך הטיפול.
    הערה: זוויות חיתוך רבות אפשריות. זווית שיטת וחלוקת חסימה המדויק יהיה תלוי על אזור המוח המדויק, סוג התא, מעגל שילמדו.
  5. מוספית שאבן המוח בעל הדגימה באמצעות דבק דבק. . משכי את החלק הפנימי של בעל הדגימה מספיק כדי לפרוש את הבלוק המוח לגמרי מבפנים. שופכים את agarose מותכת ישירות לתוך המחזיק עד הרחוב המוח מכוסה לגמרי agarose. תהדק את האביזר טרום מקורר מצמרר בלוק סביב בעל הדגימה ~ 10 s עד חיזק agarose.
  6. הכנס בעל הדגימה הקיבול על המכונה מבצעה ואמת יישור תקין. למלא את מאגר המים הנותרים טרום מקורר, מחומצן NMDG-HEPES חנה המבר מ כשהספל 250 מ ל, להזיז אבן בועות לתוך המאגר משך זמן לחתוך כדי להבטיח חמצון נאותה.
  7. התאם את מיקרומטר להתחיל לקדם את הדגימה המוח agarose-מוטבע. בפורס ומתחילים מדעית להתאים את מהירות מראש ותדירות תנודה לרמה הרצויה.
    הערה: שתי ההגדרות צריך להיות בטווח נמוך. לקבלת תוצאות מיטביות, עוברים יחיד של הזרוע להב צריך לקחת כ 20 s ותנודה של צריך לייצר רעש מאוד חלקה ועדינה מזמזם עם שום זמזומים עבירה.
  8. המשך קידום, חותך את הרקמה 300 במרווחים מיקרומטר (או עובי המועדפת אחרים) עד אזור המוח עניין לחלוטין למחלקה; הזמן הכולל עבור ההליך עם פרוסות צריך להיות פחות מ 15 דקות.

5. אופטימיזציה הליך ההתאוששות מגן NMDG

  1. צעד שחזור ראשוני NMDG (שלב קריטי): עם סיום ההליך אופטים, לאסוף את כל הפרוסות באמצעות ניתוק פלסטיק פסטר צינור t ולהעביר אותם לתא ההחלמה הראשונית ומחוממת מראש (34 ° C) מלא 150 מ ל כלנית חדד NMDG-HEPES. להעביר את כל הפרוסות ברצף קצר ולהתחיל שעון עצר ברגע כל הפרוסות מועברים לחדר התאוששות.
  2. עיין בטבלה 2 כדי לקבוע Na+ אופטימלי בספייק הזמנים על פי גיל העכבר.
    הערה: הליך זה הוא שיטה מעשית להשגת קצב מבוקרת של בעלי חיים לטבע של Na+ אל החדר פרוסה המוח ואת מיטבית של המוח ספציפי פרוסה קאמרית הגיאומטריה מאגר וכרך וסוג (ראה טבלה של חומרים).
  3. לבצע stepwise Na+ ספייק-in ההליך על-ידי הוספת אמצעי האחסון שצוין של Na+ ספייק-אין פתרון הצביעו פעמים. הוסף הפתרון ספייק ב- Na+ ישירות לתוך הארובה bubbler לשכת ההחלמה הראשונית כדי להקל על ערבוב מהיר.
  4. העברת כל הפרוסות לתא HEPES חנה המבר לטווח ארוך אחזקות נשמר בטמפרטורת החדר. לאפשר פרוסות להתאושש במשך שעה 1 נוספים ב- HEPES מחזיק קאמרית לפני ליזום תיקון קלאמפ הקלטה ניסויים.

6. תיקון קלאמפ הקלטה

הערה: ההליכים הבסיסיים הבאים רק לספק כמה שיקולים מעשיים ולא נועדו לייצג את הפרוטוקולים מפורט להקלטות מלחציים תיקון, כמו אלה ניתן למצוא במקומות אחרים53,54. מעטה אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון נדרש עבור יישום זה. זה יהיה בדרך כלל מורכב מיקרוסקופ זקוף מצויד אופטיקה חדות (IR-DIC) התערבות דיפרנציאלית אינפרא-אדום, מערכת תאורה פלורסצנטיות, תיקון קלאמפ מגבר עם נתונים digitizer, מוטורי micromanipulator, מיקרוסקופ פלטפורמה, רטט בידוד טבלה, כלוב פאראדיי ומערכת פתרון חימום זלוף. הדגימה קאמרית ואת פלטפורמת צריך להיות מתוכנן עבור הקלטת המשוקע פרוסה. להקלטות מלחציים תיקון נוירון רב, נדרש מעטה מצוידים עם מספר מגברים, ראש בשלבים, micromanipulators באיכות גבוהה. בנוסף, לקבלת תוצאות מיטביות, מעטה מצויד 900 ננומטר IR מסנן, התאמת רכיבים אופטיים מומלץ מאוד כדי להבטיח הדמיה נאותה של תאים ממוקם > 50 מיקרומטר עמוק בתוך פרוסות המוח. יישור תקין לתאורת Kӧhler חשוב גם עבור פריט חזותי ברור.

  1. להכין פתרון פיפטה תאיים (במ מ): 130 K-Gluconate, 4 10 phosphocreatine-נה2, 4 MgATP, נה 0.3 0.3 EGTA, 10 HEPES, אשלגן כלורי2-GTP, ו- 13.4 biocytin. להתאים את ה-pH ל 7.35 עם 1 מ' קו את osmolality עד 285-290 mOsmol/ק ג באמצעות סוכרוז כנדרש.
  2. להכין אלקטרודות מלחציים תיקון מ בעובי דופן זכוכית בורוסיליקט נימים... האלקטרודה מלחציים תיקון אידיאלי יש נר קצר יחסית, גמד עם ~ 3 – 6 MOhm מלא עצה ההתנגדות באמבטיה.
  3. ודא החוטים אלקטרודת כסף chlorided כראוי על מנת להבטיח הקלטות יציב. לעשות את זה 3-4 מ מ הכסף (אופייני) מאת השוקע האחרון תיל בתוך נוזל אקונומיקה במשך כ 30 דקות או עד החוט הופך לשחור.
  4. להקים זלוף פתרון באמצעות משאבה סחרור מוגדר כ- 3-4 מ ל לדקה Circulate carbogenated הקלטה חנה המבר דרך החדר הקלטה דואגת להתאים תזרים, יצוא כדי למנוע גלישה.
  5. העברת פרוסה מוח אחד לחדר ההקלטה ועלייתו ולאבטח במקום באמצעות עוגן בצורת פרסה פרוסה עם ניילון לחצות מחרוזות. זיהוי אזור המוח היעד באמצעות מטרה אוויר X 4 לפני המעבר מטרה גבוהה יותר כוח (למשל, מפתח נומרי גבוה 40 X או 60 X מים טבילה מטרות).
  6. זיהוי חזותי של תא המטרה בריא. המראה של קרום עצביים-סומא, כפי דמיינו ידי מיקרוסקופ IR-DIC, משמש כדי לשפוט את התאמתו של המועמד תא להקלטה מלחציים תיקון.
    הערה: נוירונים בריא בדרך כלל להציג את התכונות הבאות: לא שחניכיה ולא נפוח somata, חדות רכה של קרום בקצוות, והמראה ממברנה חלקה. בנוסף, הרוב המכריע של תאים בריאים ממוקמים > 30 מיקרומטר עמוק בתוך הפרוסה, כמו נוירונים שטחית נוטים להיפגע עם ניתקה את התהליכים דנדריטים. יש להימנע נוירונים כי התערוכה מראה מקומט, נראה בבירור גרעינים או מראה 'מטוגן ביצה' או קצוות קרום כהה מאוד או גבוהה חדות.
  7. מילוי חוזר התיקון פיפטה עם ~ 5 µL של פתרון תאיים, להעמיס אותם על המחזיק אלקטרודה. להזיז את פיפטה לאמבטיה הקלטה מעל הפרוסה המוח ולהחיל לחץ חיובי קל לנקות כל הפרעה בקצה. אפס את ההיסט פיפטה ונטר את ההתנגדות עצה באמצעות פונקציית בדיקת קרום.
  8. להזיז את הטיפ פיפטה במגע עם גוף התא של נוירון המטרה; גומת חן קטנה צריך טופס על פני הממברנה בלחץ חיובי קל.
  9. ברגע גומת חן ממברנה נצפית, במהירות להסיר את הלחץ ולהחיל יניקה עדינה כדי להקל על היווצרות חותם. ברגע ההתנגדות פיפטה עולה ל > 100 MOhm, להפעיל פקודת המעצר לרמה התואמת את הקרום המנוחה הצפויה פוטנציאליים עבור סוג התא יישוב (-70 mV היא נקודת התחלה טובה).
  10. ברגע ההתנגדות עצה מגיע ≥1 ג'יגה אוהם, מנסים לפרוץ את התא על ידי קורעת את הקרום מתחת פיפטה תיקון שימוש התקפי קצר של שאיבה חדה; התכונה 'זאפ' עשוי להיות מנוצל כדי להקל על הפריצה כנדרש.
    הערה: פוטנציאל החזקה של-70 mV מוצעת לניסויים קלאמפ מתח על נוירונים בקליפת המוח. נוירונים בריא תהיה דליפת הנוכחי שלילי לא יותר מ-100 הרשות לתקופת הניסוי, אבל זה חלק תלויה בסוג התא. נוירון תשתף מניתוח אם פוטנציאל ממברנה מנוחתו היה depolarized יותר מ-50 mV, או אם גישה ההתנגדות לשינוי על-ידי יותר מ- 20%.
  11. ברגע הקלטה מלחציים תיקון שלם-תא יציב מתקבל, יעד נוירונים נוספים עבור הקלטה חוזרת צעדים 6.6-6.10. לטפל כדי למנוע הפרעות מכניות אשר יוביל מאבד את ההקלטה הראשונה.
    1. בחר נוירונים נוספים בתוך 100 מיקרומטר הנוירון הראשון כדי להבטיח הסתברות סבירה של מציאת נוירונים מצמידים synaptically.
      הערה: זה עשוי להיות שימושי במקרים מסוימים כדי לזהות מספר הנוירונים המועמד מקדימה כדי לטעון מראש ומקם מראש כל פיפטות סמוכים לתאים יישוב שונים לפני הקמת את ההקלטה הראשונה של קלאמפ תיקון.

Representative Results

סעיף זה מספק תוצאות נציג עבור המוח שגרתית פרוסה והכנה תיקון קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה ניסויים באמצעות פעולת השירות לשחזור מגן ממוטב NMDG (כלומר, NMDG מגן התאוששות בשילוב עם הדרגתית Na+ ספייק-אין הליך). שימור הראשון, מורפולוגי נוירונים הוערך באזורים שונים במוח של פרוסות המוח המוכן עם או בלי ליישם את שיטת שחזור מגן ממוטב NMDG (איור 1). שלושה עכברים בוגרים בן חודש נבחר עבור ניסויים אלה, השתמשנו IR-DIC מיקרוסקופ כדי לקבוע נוירון בריאות המבוססת על הצורה והמראה הכללי של somata ו דנדריטים הפרוקסימלית. שימו לב למראה pyknotic מצומקת, רוב הנוירונים של תמונות נציג של פרוסות המוח מוכן ללא שיטת שחזור מגן (כל התמונות התקבלו h 1-2 לאחר הכנה פרוסה). פרוסות שליטה אלה הוכנו באמצעות כלנית חדד NMDG עבור transcardial זלוף וחלוקת צעדים אבל בתחילה התגלו ב Na גבוהה+-המכילים כלנית חדד HEPES. לעומת זאת, תמונות נציג מ הפרוסות שהוכנו באמצעות שיטת אופטימיזציה של שחזור מגן NMDG לחשוף את הנוירונים עם שיפור מורפולוגיות (וחלק יותר, מלאים יותר, פחות מראה מקומט) המתאימים מלחציים תיקון הקלטה (איור 1)-שימור עצביים משופרת נצפתה על פני אזורים במוח מרובים כולל neocortical שכבות II/III ו- V, subiculum, הגבי גרעין הברך הצדי (dLGN).

בשלב הבא, שיטת אופטימיזציה של שחזור מגן NMDG נמשל בשיטה המקורית NMDG השחזור מגן (קרי, ללא Na+ הדרגתית ספייק-אין הליך). הזמן הממוצע עבור ג'יגה אוהם חותם-צורה מלחציים תיקון הקלטה ניסיונות באופן דרמטי, באופן משמעותי צומצם (9.9 s לעומת 33.3 s, * *p < לזווג 0.005, t-מבחן) מתי הוחל Na+ הדרגתית ספייק-אין הליך יחד עם הצעד שחזור מגן NMDG (איור 2). קרום מהיר ואמין יותר איטום פעמים רבות לשפר את התפוקה של קלאמפ תיקון הקלטה לפרוסות המוח למבוגרים צעירים. נה+ אופטימלי בספייק לוח הזמנים השתנה עוד יותר על פי גיל בעלי חיים (טבלה 2) והיה מועיל לכל הגילאים נבדק (3 שבועות לעכברים בן שנה). הפרופיל של העלאת ריכוז יון נתרן הדרגתי לאורך כל הקורס של ההליך ספייק-in מסופק (איור 3) ללוות את לוחות הזמנים המוצגים בטבלה 2.

כחלק מן התוכנית סוגים (http://celltypes.brain-map.org/) תא מכון אלן שמאמץ בקנה מידה גדול נמצא בשלבי כדי באופן שיטתי לאפיין את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות מהותי של נוירונים בודדים למבוגרים צעירים (יום לאחר הלידה 40-80) העכבר חזותיים מוח קליפתי פרוסות נגזר הטרנסגניים קווים עם תא סמן פלורסנט ייחודיים לסוג ביטוי באוכלוסיות גנטית מוגדרת על-ידי עצביים (שכבה קורטיקליים ו סוג התא שורות מסוימות של התקן Cre עבר פלורסנט תלויי-Cre כתב קו55). איור 4 מראה דוגמה עקבות של הדפוסים ירי הקליטה של Parvalbumin (Pvalb)-הבעת קורטיקלית עולה מהר (FS) interneurons (Pvalb-IRES-Cre/Ai14 עכברים) בתגובה לסדרת 1 s נוכחי הזרקת שלבים שמכסים את הטווח הדינמי של נוירון ירי. לקרן-אני עקומת עבור dataset של 22 interneurons FS בקליפת המוח מוצגת בצד ימין. בדומה ממוקד תיקון קלאמפ הקלטה הניסויים בוצעו לאפיין 23 לבטא Rorb מעוררות נוירונים שכבה IV של עכברים Rorb-IRES-Cre/Ai14 (איור 4). סוגי נוירון בריא מגוונות כולל FS interneurons ו נוירונים הפירמידלית הבנויה על פני אזורים קורטיקליים ושכבות באופן שגרתי ובאמינות ניתן לפלח עבור תיקון קלאמפ מהקלטה לפחות 6-8 שעות לאחר ההכנה פרוסה בעזרת זה אופטימיזציה פרוטוקול.

בנוסף מדידת מאפיינים עצביים מהותי, נבדקה סינפטית קישוריות בין נוירונים מרובים המוקלטת בו זמנית של סוגים המוגדרים בחזותי מתוכנת קורטיקלית. המלחציים נוירון רב תיקון הקלטה טכניקה באופן יוצא מן הכלל דורש, כמו נוירונים רבים המועמד בריא של סוגים המוגדרים חייבים להיות נוכחים בתוך שדה קטן יחסית של הפרוסה המוח על מנת להבטיח סיכוי סביר להשגת איכות גבוהה הקלטות בו-זמנית, זיהוי קשרים סינפטיים פיד ה bona . איור 5 מציג הקלטה המכפלות של שני tdTomato + FS interneurons קליפת הראיה של פרוסות המוח נגזר עכברים Pvalb-IRES-Cre/Ai14 למבוגרים צעירים. חד כיווני מעכבות סינפטית חיבור חזק זוהה (הקליט עם פתרון פיפטה פנימי גבוה כלוריד). דוגמה הקלטות ופרוטוקולים למדידת תכונות פלסטיות סינפטית לטווח קצר מוצגים. התקפי של גירוי הרכבת בתדירות גבוהה (10 פולסים כל-10, 50 ו- 100 הרץ) הובילו פולסים מבחן יחיד שחזור במרווחי זמן שונים (1, 2 או 4 s) כדי למדוד את מסלול זמן ההחלמה מדיכאון סינפטית.

הצלחה מעולה התקבל גם עבור האדם neocortical נוירונים בוגרים מבוגרים שמחוץ פרוסות המוח. דגימות נוירוכירורגיים מתקבלים מן בחולים שעברו ניתוחים מתוזמנת להסרת הגידול בבתי חולים מקומיים. לנהלים בדבר הובהלת. מרקמות המוח ואוסף פרוסה הכנה שונים מהנהלים פרוסה מוח העכבר כמה דרכים מעשיות. בקצרה, הרקמה neocortical resected (דיסטלי לאתר של פתולוגיה) שנאסף חדר הניתוח שקוע אל תוך קר כקרח מחומצן כלנית חדד NMDG-HEPES ואני מועבר עם רציף מצמררת, חמצון של חדר הניתוח מעבדה בתוך 30 דקות או פחות. פרוסות המוח שהוכנו באמצעות ההליך לשחזור מגן NMDG, מותר לשחזר למשך זמן ממושך של-3 שעות לפני ביצוע תיקון קלאמפ הקלטות. איור 6 מראה הצלחה לזווג הקלטה ניסוי, ניסוי מוצלח תיקון קוודרופל (לארבעה) הקלטה קלאמפ מן האדם שמחוץ פרוסות המוח שהוכנו בצורה זו מן האזור החזיתית. ההקלטה לזווג מדגים חד כיווני קלט סינפטית סינאפסות נוירון כפירמידה בקליפת המוח אל interneuron בקליפת המוח (שהוקלט סינאפסות זרמי postsynaptic). במדבקה מרובע ניסוי שני סינאפסות שני נוירונים מעכבות נרשמו בו זמנית ולאחר שלושה קשרים סינפטיים מעכבות אותרו (שהוקלט מעכבות פוטנציאל postsynaptic) מתוך שתים עשרה חיבורים הכולל ובחן. לפיכך, מתודולוגיה זו פרוסה ממוטבת המוח מאפשר אמין ניסיוני הצלחה המאתגרות ביותר של המוח פרוסה יישומים, כולל תיקון נוירון רב ניסויים קלאמפ מעגל חיבוריות במוח בחריפות resected בוגרת למבוגרים האנושי רקמות.

figure-representative results-5793
איור 1: השתפר שימור עצביים באמצעות שיטת שחזור מגן NMDG אופטימיזציה של המוח פרוסה הכנה- נציג IR-DIC תמונות נרכשו מאזורים במוח מגוונות בפרוסות חריפה של עכבר בת שלושה חודשים. לשלוט NMDG לשיטת הביתור מגן ללא צעד שחזור מגן (לוחות שמאלה) לעומת NMDG אופטימיזציה שחזור מגן שיטה (לוחות נכון). (א) שכבה V של קליפת, (B) שכבה II/III של קליפת, subiculum (ג) ו- (ד) הגבי גרעין הברך הצדי (dLGN). ברים בקנה מידה כל לוחות הם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-representative results-6622
איור 2: נתיב מהירות ואמינות משופרת של ג'יגה אוהם חותם-צורה מלחציים תיקון רישום ניסויים באמצעות שיטת שחזור מגן NMDG Na+ ספייק-אין הליך. (א) מגרש היווצרות חותם ג'יגה אוהם פעמים להתאוששות NMDG לבד (שחור נקודות נתונים, n = 19) לעומת NMDG השחזור פלוס Na+ ספייק-אין הליך (נקודות נתונים אדום, n = 23). כל התאים מוקלטים היו נוירונים כפירמידה בשכבה II/III או V של קליפת הראיה. שימו לב, הזמן המקסימלי הוא הכתיר ב-100 s עבור תאים כי מעולם לא יצרו חותמות ג'יגה אוהם. מזווגים t-לבדוק, * *p < 0.005. (B) העלילה של נח קרומית אפשרית (RMP) של נוירונים כפירמידה שכבה V (נקודות נתונים כתום, n = 10/11), נוירונים כפירמידה II/III (ירוק נקודות נתונים, n = 9/10), או interneurons Pvalb + FS בקליפת המוח (כחול נקודות נתונים, n = 23/22). החוגים מוצק מציינות את מצב שחזור NMDG ופתח שחזור NMDG עיגולים בתוספת Na+ ספייק-אין הליך. כל נקודת נתונים מייצג נוירון אחד, שני הממוצע, + /-SEM מוצגים. אין הבדלים משמעותיים ב RMPs השוואה בין המוח פרוסה הכנה התנאים עבור כל שלושת תא סוגים (מזווגים t-מבחן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-representative results-8023
איור 3 : פרופיל של העלאת ריכוז יון נתרן הדרגתי לאורך כל הקורס של ההליך ספייק-ב. (א) העלילה של ספייק-ב NaCl ריכוז נגד הזמן. (B) חלקת הריכוז NaCl חוץ-תאית נגד הזמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-representative results-8560
איור 4 : מהותי אלקטרופיזיולוגיות מאפיינים של סוגי גנטית מוגדרת על-ידי תאים קורטיקליים. (א) דוגמה עקבות של ירי עצביים בתגובה הנוכחי שלבי הזרקת Pvalb + קורטיקלית FS interneurons (החלונית הימנית). tdTomato + נוירונים ממוקדים להקלטות פרוסות המוח של עכברים Pvalb-IRES-Cre/Ai14 נתוני סיכום עבור ירי קצב-נוכחי הזרקת היחסים (F-אני עקומת) מוצגים בצד ימין (n = 22). (B) דוגמה עקבות של ירי עצביים בתגובה שלבי הזרקת הנוכחי לבטא Rorb קורטיקלית שכבה IV סינאפסות נוירונים (החלונית הימנית). tdTomato + נוירונים ממוקדים להקלטות פרוסות המוח של עכברים Rorb-IRES-Cre/Ai14 נתוני סיכום עבור ירי קצב-נוכחי הזרקת היחסים (F-אני עקומת) מוצגים בצד ימין (n = 23). כל חבל דק בצבע מייצג את F-אני עקומת עבור נוירון בודד; ואילו הקווים שחור עבה מייצג את הממוצע עבור כל קבוצה + /-ב-SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-representative results-9686
איור 5: פלסטיות לטווח קצר ב synaptically מחובר interneurons קורטיקלית לבטא Pvalb FS- (א) הפרעות דיפרנציאלית ניגודיות epifluorescence שימשו למטרה interneurons FS tdTomato-חיובי, Pvalb-ביטוי של קליפת הראיה העיקרית העכבר. צבע מקודד תרשים סכמטי קישוריות מפגין חיבור סינפטית חד צדדית בין interneurons שני. תיאור סכמטי של הפרוטוקולים גירוי להערכת dynamics לטווח קצר של נוירונים המחוברים synaptically (B). רכבות של פוטנציאל פעולה 10 (10, 50 ו- 100 הרץ) המתעוררים הנוירון presynaptic, ואחריו יחיד פוטנציאל הפעולה (שחזור בדיקת הדופק, RTP) נמסר עם השהיית זמן שונים (1, 2 ו- 4 s) לאחר הרכבת הופסק. כל RTP הם צבע מקודד עבור בהירות. (ג) ממוצע עקבות המתאימים חד-צדדית מעכבות הפוסט-סינפטית פוטנציאל (uIPSPs) בתא #2 בתגובה רכבות של פוטנציאל פעולה עורר תא #1. שיבוץ אפור התרחב סרגל זמן להראות תיחום של הרכבת uIPSP. (ד) Normalized uIPSP amplitudes מותוות כפונקציה של המיקום שלהם במהלך רכבות בתדרים שונים. דיכאון נטו הוא ברור על פני כל קלט את המחירים התאוששות משמעותית של uIPSP ב-4 ס אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-representative results-11059
איור 6: הקלטות מלחציים תיקון נוירון רב-נוירולוגי למבוגרים אנוש המוח פרוסות. תמונות ההגדלה נמוך וגבוה IR-DIC (A) המציין את המיקום ואת זהותו של הנוירונים מוקלטות (לוחות העליון). נוירון כפירמידה (כוכבית שחור) עם השכן interneuron (בכוכבית אדומה) נרשמו בו זמנית. לדוגמה צבע מקודד עקבות של חיבור סינפטית סינאפסות חד כיווני (ESPC) מתא כפירמידה interneuron (נמדד במתח קלאמפ כמו EPSCs), החיבור הפיזי המקביל מפה (לוחות התחתון). (B) תיקון מרובע קלאמפ הקלטה בניסוי פרוסה למבוגרים המוח נוירוכירורגיים האנושי של הבדיקה נגמרה. שני נוירונים כפירמידה, interneurons שני נרשמים בו זמנית, המאפשרות בדיקה רציפה של 12 קשרים סינפטיים אפשרי. רכבת של פעולה לפוטנציאלים תא #3 (עקבות ירוק) הובילו גילוי של פוטנציאל פוסט-סינפטיים מעכבות (IPSPs) בכל אחד אחר שלושה מוקלט בו זמנית הנוירונים (שלושה אזורים מסגרת, לוחות העליון). התגובות הקליטה של כל נוירון הפרט הם צבע מקודד עבור בהירות. המפה הקשר גופניות מוצג בחלונית התחתונה. הערה עקבות raw שמוצג (B) מייצגים את הממוצעים לפחות 20 הנתונים הגולמיים רצופים מטאטא. זיהוי בשם של סוג התא היה מבוסס על הצורה סומא, ניתוח של מורפולוגיה מאת הפלורסנט מילוי במהלך הקלטות ומאפיינים מהותי אלקטרופיזיולוגיות כולל את דפוסי הירי בתגובה נוכחי הזרקת צעדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כלנית חדד NMDG-HEPESHEPES אחזקות כלנית חדדהקלטה כלנית חדד
רכיבמ מMWגרם/ליטרמ מMWגרם/ליטרמ מMWגרם/ליטר
NMDG92195.2217.96
HCl9236.46*
NaCl9258.445.3812458.447.25
אשלגן כלורי2.574.550.192.574.550.192.574.550.19
2PO NaH4 1.2138.000.171.2138.000.171.2138.000.17
NaHCO3 3084.012.523084.012.522484.012.02
HEPES20238.314.7720238.314.775238.311.19
גלוקוז25180.204.5125180.204.5112.5180.202.25
סודיום אסקורבט5198.000.995198.000.990198.000.00
Thiourea276.120.15276.120.15076.120.00
פירובט נתרן3110.040.333110.040.330110.040.00
MgSO4.7H2O10246.485 מ2246.481 מ"ל2246.481 מ"ל (2 מ' מניות)
CaCl2.2H2O0.5147.010.25 mL2147.011 מ"ל2147.011 מ"ל (2 מ' מניות)
* titrate ה-pH של כלנית חדד NMDG-HEPES עד 7.3-7.4 באמצעות HCl מרוכזת
כל הפתרונות צריך להיות בטווח 300-310 mOsm/Kg

טבלה 1: מדיה ניסוחים.

בעלי חיים גיל
הזמן (דקות) *< 1 חודש1-3 חודשים 3–6 חודשים 6–12 חודשים 12 + חודשים
0250 ΜL250 ΜL
1
2250 ΜL
3
4500 ΜL
5250 ΜL250 ΜL
61000 ΜL
7
82000 ΜL
9
10העברה500 ΜL250 ΜL250 ΜL
11
12
13
14
151000 ΜL500 ΜL250 ΜL250 ΜL
16
17
18
19
202000 ΜL1000 ΜL500 ΜL250 ΜL
21
22
23
24
25העברה2000 ΜL1000 ΜL500 ΜL
26
27
28
29
30העברה2,000 ΜL1,000 ΜL
31
32
33
34
35העברה2,000 ΜL
36
37
38
39
40העברה
* זמן אפס זה שהפרוסות רגע מועברים אל החדר ההחלמה הראשונית

בטבלה 2: זמנים מומלצים נה הדרגתית + ספייק-אין הליך על פי גיל העכבר.

Discussion

נה + ספייק-in משפר את היווצרות חותם ג'יגה אוהם, מלחציים תיקון הקלטה הצלחה
הגירסה הראשונית של שיטת שחזור מגן NMDG תוכנן במיוחד עבור בוגרים ובעלי הזדקנות2,5. שכמה מהמקדימים ביקשו גם ליישם מתודולוגיה זו כדי לחתוך קטין החייתי במוח (כלומר, עכברים < בת 30 ימים). עם זאת, זה נרשמה כי בניגוד מצטיינים ואושרו מבחינה ויזואלית עצביים שימור באמצעות שיטת שחזור מגן NMDG בטווח הגיל הזה, היווצרות חותם ג'יגה אוהם יכול לעתים קרובות לעכב, שמוביל מלחציים תיקון כושל להקליט ניסיונות. אחת ההשערות היא כי קטיונים NMDG יותר בקלות לכוד בתוך פרוסות המוח ילדותי ביחס פרוסות המוח למבוגרים יכולים לעכב היווצרות ים; אולם, חותמות ג'יגה אוהם יכול ליצור בקלות בזמן פרוסות המוח לנוער הם שקועים לחלוטין NMDG כלנית חדד (נתונים לא מוצג), ובכך כמסמן את NMDG חנה המבר כשלעצמו הוא לא הפגיעה ג'יגה אוהם חותם היווצרות.

המעבר נמוך-גבוהה פתרון Na+ בסיום השלב הראשוני במוח פרוסה שחזור מהיר גורם נזק לממברנות עצביים, perturbs את תהליך היווצרות של החותם. זה אינטואיטיבי נתון כי המעבר נמוך-גבוהה Na+, הטמפרטורה הקרה-אל-חמה, העלאה דרמטית של Ca2 + מ ג2 + יחס להוביל באופן קולקטיבי תחייתו מסיבית של פעילות סינפטית ספונטנית. שלב זה ריבאונד מעכבות במוח עם פרוסות הליך סביר להניח מראה פגיעה פגיעה reperfusion לאחר עלבון איסכמי. לכן, בכדי להמתיק נזק הממברנה עצביים בשלב ההחלמה הראשונית ש-na+ הדרגתית ספייק-אין נוהל נכלל בהן העלאת ריכוז Na+ בחדר דגירה שחזור מגן NMDG הוא לאט לאט reproducibly מוגבה עם תזמון מדויק. ההליך לשחזור מגן המקורי, דיסוציאציה הטמפורלי של Na+ העלאה של טמפרטורה, Ca2 +/Mg2 + יחס גובה הוא מועיל. אבל בנוסף, ההליך ספייק ב- Na+ מוביל לעלייה מצטבר קטן ריכוז Na+ חוץ-תאית על נקודות זמן מוקדם ועל עליות גדולות לקראת נקודות זמן מאוחר, כך יכלו על רקמת המוח הזדמנות כדי להתאים טוב יותר את רמות Na+ העולה. ההליך זה שאלטרנטיבה לפתרון הדרגתי exchange נשלט על ידי משאבת זלוף או כוח המשיכה של קווי טפטוף אשר ולהוביל לעלייה מתמדת Na+ רמות ודורשים תשומת לב תזרים והן יצוא כדי למנוע הצפת החדר פרוסה. ראוי לציין, זה נה+ הליך ספייק-in osmolality הפתרון בבית הבליעה פרוסה בהדרגה עולה על פני תקופה של מספר דקות לפני הפרוסות מוחזרות לפתרון osmolality נורמלי, אך לא השפיעה לרעה על בריאות פרוסה או תיקון קלאמפ הקלטה הצלחה. פתרון חיתוך osmolality גבוהה כבר בעבר בשימוש על ההכנות פרוסה המוח האמצעי על מנת לשמר טוב יותר נוירונים דופאמין עבור תיקון קלאמפ הקלטות57,58, לפיכך הוכחת כי זה זמני hyperosmolality עשוי להיות מועיל בהקשרים מסוימים.

על-ידי הטמעת הליך בלתי אופטימליים המשלב את שיטת שחזור מגן NMDG ו- Na הדרגתי+ הוארך בספייק שלב השירות של מתודולוגיה זו פרוסה המוח לכסות לנוער במשך הדורות בוגרים בעלי חיים למבוגרים. פרוטוקול מעודכן זה מתאים עכשיו מגוון הגילאים בעלי חיים באמצעות יחיד אופטימלי NMDG חנה המבר גיבוש נוהל. במידת הצורך, ניתן להחיל על ההליך ספייק ב- Na+ עם עיכוב למחמיר יותר ו/או קורס איטי יותר זמן כדי לשפר את הכדאיות של המוח פרוסות מחיות בוגרים, אנו מגישים מדריך בסיסי של מומלצים ספייק-אין לוחות זמנים לפי לחיה גיל (ראה טבלה 2). בזמן שאנו מספקים מסגרת בסיסית מתאים עבור מגוון רחב של יישומים, ניתן לסייר שלבים מתקדמים נוספים לשיפור נוסף הכדאיות ואריכות ימיהם של המוח פרוסות מחיות למבוגרים ובטיפולים. לדוגמה, אסטרטגיות שחזור גלוטתיון יעילים במיוחד בהקשר זה, ניתן ליישם כמתואר2,6.

שיפור תפוקה מאתגרת ניסויים
הניתוח של קישוריות סינפטית על ידי הקלטה מלחציים תיקון הוא יישום תובעני שדורש מעולה לשימור המבנה העצבית ותפקוד על מנת להשיג אמינות גבוהה של הצלחה. ככל שמספר נוירונים שיירשמו בו זמנית עולה באופן ליניארי, רמת הקושי הטכני עולה העל-לינארית. ישנם מצבי כשל רבים, אחד הגורמים בתדירות הגבוהה ביותר של כשלים הוא חוסר היכולת טופס חותמות ג'יגה אוהם נאותה על אחד או יותר של תאים יישוב. הדבר באופן דרמטי יכול להאט את התקדמות, במיוחד כאשר שלושה או יותר נוירונים חייב להיות מוקלט בו זמנית. תואם את הממצא יותר מהר ג'יגה אוהם חותם היווצרות הזמן עם שיטת אופטימיזציה של שחזור מגן NMDG, היה שיפור שיעור ההצלחה ואת התפוקה של נוירון רב תיקון קלאמפ הקלטה ניסויים עם שני מבוגרים מהונדס העכבר מוח ופרוסות למבוגרים מוח הנוירוכירורגית. יעילות משופרת היא קרוב לוודאי המיוחס היווצרות חותם ג'יגה אוהם יותר מהיר ואמין והן לשימור עצביים משופר הפרוסות עם פרוטוקול זה. למרות פרוטוקול זה מתמקד ביתרונות במפורש עבור תיקון קלאמפ הקלטה יישומים, הישגים דומים הם הצפוי ליישומים אחרים ניסיוני ומאתגר שבו המוח פרוסה הכדאיות הוא בעל חשיבות עליונה.

Acknowledgements

עבודה זו מומן על ידי מכון אלן למדעי המוח. המחברים רוצים להודות מכון אלן המייסדים, פול ג' אלן, אלן ג'ודי, של החזון שלהם, עידוד ותמיכה. אנו מודים גם צוות התמיכה הטכנית אלן מכון לביצוע טיפול בבעלי חיים, גידול ו genotyping.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Compresstome VF-200Precisionary InstrumentsVF-200Vibrating tissue slicer (recommended)
N-methyl-D-glucamineSigma AldrichM2004aCSF constituent
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014aCSF constituent
Potassium ChlorideSigma AldrichP5405aCSF constituent
Sodium Phosphate monobasic dihydrateSigma Aldrich71505aCSF constituent
Sodium BicarbonateSigma AldrichS5761aCSF constituent
HEPESSigma AldrichH4034aCSF constituent
GlucoseSigma AldrichG7021aCSF constituent
Sodium AscorbateSigma AldrichA4034aCSF constituent
ThioureaSigma AldrichT8656aCSF constituent
Sodium pyruvateSigma AldrichP5280aCSF constituent
Calcium chloride dihydrateSigma AldrichC7902aCSF constituent
Magnesium Sulfate heptahydrateSigma AldrichM1880aCSF constituent
2,2,2-Tribromoethanol Sigma AldrichT48402Anesthetic component 1
2-methyl-2-butanol Sigma Aldrich240486Anesthetic component 2
Curved blunt forcepsFine Science Tools11065-07Brain dissection tools
Fine dissecting scissors (supercut)Fine Science Tools14058-09Brain dissection tools
Large heavy duty scissors 7''Fine Science Tools14000-18Brain dissection tools
Metal spatulaSigma AldrichZ511455-1PAKBrain dissection tools
Razor bladesVWR89031-954Brain dissection tools
Brain Slice Keeper-4Automate ScientificS-BSK4brain slice holding chamber
nylon netting Warner Instruments64-0198For building small slice recovery chambers
Pyrex glass beakers (250 mL)VWR89090-434For building small slice recovery chambers
35 mm plastic dish, roundVWR100488-376For building small slice recovery chambers
Gas diffuser stones (10 µm)Sigma Aldrich59277For constant carbogenation (fine bubbles)
Agarose Type I-BSigma AldrichA0576For embedding brain specimens
Micro loader tipsEppendorf22491229For filling patch clamp electrodes
SylgardVWR102092-312For making a custom dissecting platform
Hydrochloric acid Sigma AldrichH1758-100MLFor pH adjustment of media
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich221465-25GFor pH adjustment of media
Potassium HydroxideSigma Aldrich221473For pH adjustment of media
Plastic transfer pipets 3 mL graduatedVWR89497-676For slice transfer
Zirconium ceramic injector bladesCadence Specialty BladesEF-INZ10http://cadenceinc.com/
KG-33 borosilicate glass capillary w/filamentKing Glass Companycustom quoteID: 0.87mm, OD 1.50mm
BiocytinSigma AldrichB4261Intern pipette solution
Phosphocreatine disodiumSigma AldrichP7936Intern pipette solution
Potassium GluconateSigma AldrichG4500-100GIntern pipette solution
EGTASigma AldrichE3889Intern pipette solution
Mg-ATPSigma AldrichA9187Intern pipette solution
Na2-GTPSigma Aldrich51120Intern pipette solution
sucroseSigma AldrichS0389Intern pipette solution
Heated water bath (2.5L)VWR13491-060Miscellaneous
Filter paper roundsVWR28456-022Miscellaneous
Cyanoacrylate glueAmazonB000BQRBO6Miscellaneous
Glass petri dishVWR89000-326Miscellaneous
10X Phosphate buffered salineSigma AldrichP5493Miscellaneous
30 mL syringesVWRBD302832Miscellaneous
1 mL syringesVWRBD-309628Miscellaneous
25 5/8 gauge needlesVWR89219-292Miscellaneous
Thermomixer (w/1.5 mL tube block)VWR89232-908To keep agarose molten 

References

  1. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  2. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  3. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  4. Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  5. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
  6. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
  7. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303 (3), 141-144 (2001).
  8. Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148 (4), 1004-1014 (2007).
  9. Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, 715-730 (1998).
  10. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  11. Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23 (2), 422-429 (2003).
  12. Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26 (41), 10461-10471 (2006).
  13. Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24 (27), 6228-6236 (2004).
  14. Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), 584-589 (2015).
  15. Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144 (2013).
  16. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  17. Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  18. Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31 (2), 265-270 (2015).
  19. LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
  20. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34 (29), 9506-9515 (2014).
  21. Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37 (7), 1154-1160 (2013).
  22. Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95 (1-2), 42-49 (2015).
  23. Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390 (2014).
  24. Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925 (2014).
  25. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. , (2015).
  26. Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32 (42), 14519-14531 (2012).
  27. McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8 (6), 1857-1869 (2014).
  28. Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18 (5), 728-735 (2015).
  29. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84 (3), 393-406 (2013).
  30. Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
  31. Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110 (3), 672-679 (2013).
  32. Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113 (1), 380-389 (2015).
  33. Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, 2799-2811 (2014).
  34. Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16 (12), 1764-1772 (2013).
  35. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  36. Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
  37. Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor's location. J Neurosci. 34 (9), 3253-3262 (2014).
  38. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034 (2012).
  39. Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, 3559-3576 (2014).
  40. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33 (48), 18792-18805 (2013).
  41. DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33 (4), 1486-1497 (2013).
  42. Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39 (1), 98-106 (2014).
  43. Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64 (3), 597-603 (2014).
  44. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  45. Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
  46. Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35 (2), 776-785 (2015).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501 (2014).
  49. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 9462 (2015).
  50. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9 (2), 323-336 (2014).
  51. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
  52. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
  53. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358 (2015).
  54. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
  55. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  56. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58 (6), 599-619 (1971).
  57. Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9 (7), 868-869 (2006).
  58. Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59 (2), 288-297 (2008).

Explore More Articles

132NMDGin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved