Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

इस प्रोटोकॉल एक अनुकूलित N-मिथाइल-D-glucamine (NMDG) मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के सुरक्षात्मक वसूली विधि के कार्यांवयन को दर्शाता है । एक एकल मीडिया निर्माण के लिए मज़बूती से किसी भी उम्र के जानवरों से और विविध प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए स्वस्थ मस्तिष्क स्लाइसें प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल के लिए एक व्यावहारिक गाइड है N-मिथाइल-D-glucamine (NMDG) मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी की सुरक्षात्मक वसूली विधि । कई हाल के अध्ययनों से न्यूरॉन संरक्षण और समग्र मस्तिष्क स्लाइस व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए इस विधि की उपयोगिता को मान्य किया है. जल्दी adopters द्वारा इस तकनीक के कार्यांवयन विविध प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों का उपयोग कर मस्तिष्क समारोह में विस्तृत जांच की सुविधा है और पशु उंर, मस्तिष्क क्षेत्रों, और सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला फैले । कदम सुरक्षात्मक वसूली मस्तिष्क टुकड़ा तकनीक एक अनुकूलित NMDG कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF) मीडिया तैयार करने और बढ़ाया प्रक्रिया के लिए मज़बूती से पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए स्वस्थ मस्तिष्क स्लाइसें प्राप्त करने के लिए ले जाने के लिए उल्लिखित हैं । इस अद्यतन दृष्टिकोण के साथ, एक पर्याप्त सुधार गति और gigaohm सील गठन की विश्वसनीयता पर लक्षित पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयोगों के दौरान मनाया जाता है, जबकि उत्कृष्ट न्यूरॉन संरक्षण को बनाए रखने, जिससे चुनौतीपूर्ण सुविधा प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों । प्रतिनिधि परिणाम बहु से प्रदान की जाती हैं-ंयूरॉन पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयोगों को परख synaptic कनेक्टिविटी neocortical मस्तिष्क में युवा वयस्क ट्रांसजेनिक चूहों और प्रौढ़ वयस्क मानव तंत्रिकाशल्यक नमूनों से तैयार स्लाइसें । इसके अलावा, मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया के अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि दोनों किशोर और वयस्क जानवरों के साथ संगत है, इस प्रकार मूल पद्धति की एक सीमा को हल । संक्षेप में, एक मीडिया निर्माण और मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया विभिंन प्रजातियों और उंर भर में कार्यांवित किया जा सकता है उत्कृष्ट व्यवहार्यता और ऊतक संरक्षण प्राप्त करने के लिए ।

Introduction

तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी तंत्रिका विज्ञान में एक आवश्यक प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली है । एक सदी के लगभग आधे के लिए, इस मंच संरचनात्मक मस्तिष्क क्षेत्रों और पशु प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता भर में रहने वाले मस्तिष्क के गतिशील कार्यात्मक अध्ययन सक्षम है । क्या इरादा आवेदन जैव रसायन, कार्यात्मक इमेजिंग, आकृति विज्ञान, या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी है, यह अत्यंत महत्वपूर्ण है के लिए इष्टतम अखंडता और कटा हुआ ऊतक की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए । यह इस कारण के लिए है कि अत्यधिक लचीला किशोर कुतर मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी (यानी, चूहों के लिए जन्मोत्तर दिन 30 से छोटी) की तारीख को सबसे अधिक पसंद किया गया है । परिपक्व वयस्क और उंर बढ़ने जानवरों से पर्याप्त स्वस्थ मस्तिष्क स्लाइस प्राप्त करने में कठिनाई सबसे अधिक के लिए एक दुर्जेय चुनौती साबित हो गया है और परिपक्व मस्तिष्क के कार्यात्मक वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए गंभीर सीमाओं लगाया गया है । यह पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए विशेष रूप से सच है, एक तकनीक है कि उत्कृष्ट रूपात्मक और कार्यात्मक संरक्षण की आवश्यकता है और निस्र्पक विस्तृत आंतरिक और synaptic गुणों की पहचान की एकल ंयूरॉंस के लिए अपरिहार्य है । पिछले कई दशकों के लिए, पैच क्लैंप electrophysiologists के विशाल बहुमत एक ' सुरक्षात्मक काटने ' विधि पर भरोसा किया है सुक्रोज का उपयोग कम एनए+ aCSF1 स्वस्थ किशोर से मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए, और एक तक कम हद तक, युवा वयस्क जानवरों । इस विधि आधार है कि निष्क्रिय न+ आमद और बाद में पानी के प्रवेश और टुकड़ा काटने के दौरान कोशिका सूजन सेल पर आधारित है प्रमुख अपमान है कि ंयूरॉंस के गरीब अस्तित्व की ओर जाता है, विशेष रूप से उन ंयूरॉंस में स्थित के लिए सतही परतों कि सबसे ब्लेड आंदोलन से सीधे आघात बनाए रखने की संभावना है । हालांकि, सुरक्षात्मक काटने विधि अभी भी बहुत पत्तियों परिपक्व वयस्क जानवरों से मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के लिए वांछित हो विशेष रूप से लागू aCSF की परवाह किए बिना ।

इस समस्या का एक सरल लेकिन प्रभावी समाधान2,3,4,5,6 और ' सुरक्षात्मक वसूली ' मस्तिष्क स्लाइस विधि को बताया गया है । इस विधि के मूल संस्करण एक NMDG-प्रतिस्थापित aCSF का उपयोग करता है, के रूप में NMDG सबसे बहुमुखी और विभिंन अंय उंमीदवार सोडियम आयन स्थानापंन (सुक्रोज, ग्लिसरॉल, choline, और Tris सहित) के बीच प्रभावी रूप में पहचाना गया था । मीडिया निर्माण आगे HEPES के अलावा द्वारा बढ़ाया गया था मस्तिष्क टुकड़ा शोफ का विरोध और मजबूत पीएच बफर7प्रदान करते हैं, साथ ही साथ खुराक के अलावा ऑक्सीडेटिव तनाव (तालिका 1) के हानिकारक प्रभावों प्रतिक्रिया करने के लिए । यह empirically निर्धारित किया गया था कि कम एनए+, कम Ca2 +में एक प्रारंभिक वसूली मशीन कदम, और उच्च मिलीग्राम2 + NMDG aCSF तुरंत बाद वयस्क मस्तिष्क ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया दोनों आवश्यक और सुधार के लिए पर्याप्त न्यूरॉन था मस्तिष्क क्षेत्रों, सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला पर संरक्षण, और पशु उंर3,5,6।

विशेष रूप से, क्या अब सुरक्षात्मक वसूली विधि करार दिया है के पहले अवतारों साहित्य में पाया जा सकता है1,8,9,10,11,12, 13, हालांकि परिपक्व वयस्क और उम्र बढ़ने पशु मस्तिष्क स्लाइस और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए पूरी क्षमता मान्यता प्राप्त नहीं था या इन पहले काम करता है में प्रदर्शन किया । इसके अलावा, सूक्ष्म प्रक्रियात्मक विविधताओं को विशिष्ट प्रायोगिक अनुप्रयोगों के4,14,15,16के समर्थन में उभरने के लिए जारी है । इन कई अनुसंधान समूहों के काम के सामूहिक शरीर में सुधार ऊतक संरक्षण के लिए सुरक्षात्मक वसूली विधि की मजबूती में उच्च विश्वास प्रदान । NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि अब व्यापक रूप से अपनाया गया है और कई प्रकाशित अनुसंधान वयस्क पशु मस्तिष्क टुकड़ा तैयारियों का उपयोग अध्ययन में कार्यांवित किया । इन तीव्र स्लाइस अध्ययन स्पैन neocortical3,17,18, हिप्पोकैम्पस15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, midbrain25,26,27,28,29, और hindbrain30,31,३२, ३३ , ३४ क्षेत्रों, और glutamatergic4,30, GABAergic18,20,31,३५ सहित न्यूरोट्रांसमीटर और neuromodulator प्रकार की एक किस्म ,३६, dopaminergic24,29,३७,३८, कोलीनर्जिक14,३७,३८, ३९, noradrenergic४०, और serotonergic27,28 neurotransmission । विधि भी अच्छी तरह से ट्रांसजेनिक पशुओं3,३९ या vivo वायरल इंजेक्शन17,27 में निंनलिखित से व्युत्पंन स्लाइस में optogenetic नियंत्रण के लिए अनुकूल है, 28,४०,४१,४२,४३, साथ ही कार्यात्मक Ca2 + इमेजिंग के ंयूरॉन गतिविधि2,४४ ,४५,४६. दोनों अल्पकालिक प्लास्टिक की4,४७,४८ और दीर्घकालिक प्लास्टिक के विविध रूपों के विश्लेषण16,३५,४८ गया है बताया. हाल के एक अध्ययन NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि लागू करने के लिए परिपक्व वयस्क माउस मस्तिष्क स्लाइस में दृश्य प्रांतस्था में synaptic कनेक्टिविटी की व्यापक और व्यवस्थित जांच की सुविधा octopatch रिकॉर्डिंग विंयास४९ का उपयोग कर-एक शक्तिशाली उपयोगिता और इस विधि की मजबूती का प्रदर्शन । सुरक्षात्मक वसूली विधि भी पहले अप्रत्याशित प्रयोगात्मक संदर्भों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जैसे, वयस्क cortical मस्तिष्क स्लाइसों में vasculature और pericytes के बेहतर संरक्षण५०, से पैच दबाना रिकॉर्डिंग 1 में प्रत्यारोपण ंयूरॉन आबादी-1.5 वर्ष पुराने अल्जाइमर रोग माउस मॉडल20, और एक वयस्क मस्तिष्क टुकड़ा रिसेप्टर तस्करी परख५१।

निम्न प्रोटोकॉल तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के एक अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि को लागू करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रियाओं का वर्णन. बेहतर न्यूरॉन संरक्षण के लिए सिद्धांतों पर चर्चा कर रहे हैं, साथ ही दोनों युवा वयस्क ट्रांसजेनिक माउस मस्तिष्क स्लाइस और परिपक्व वयस्क में जटिल बहु-ंयूरॉन पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयोगों के लिए इस पद्धति का स्पष्ट लाभ का प्रदर्शन मानव तंत्रिकाशल्यक ब्रेन स्लाइसेस. निंनलिखित प्रोटोकॉल चूहों के लिए 21 दिन पुराने से अधिक एक साल पुराने, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वयस्क रोगियों से व्युत्पंन मानव तंत्रिकाशल्यक नमूनों के लिए मांय किया गया है ।

Protocol

ट्रांसजेनिक चूहों को शामिल प्रक्रियाओं मस्तिष्क विज्ञान के लिए एलन संस्थान में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है । इन प्रयोगों में नर और मादा C57BL/6 चूहों (वजन सीमा 10-30 ग्राम) का प्रयोग किया गया । प्रतिनिधि परिणाम के कुछ मानव मस्तिष्क स्लाइसें रहने से एकत्र आंकड़ों का वर्णन । Neocortical ऊतक नमूनों ट्यूमर हटाने के लिए neurosurgeries के दौरान प्राप्त किया गया । यह रोग ऊतक तक पहुँच प्राप्त करने के लिए neocortical ऊतक को दूर करने के लिए आवश्यक था । सूचित रोगी सहमति स्वीडिश चिकित्सा केंद्र के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल के तहत अनुसंधान प्रयोजनों के लिए तंत्रिकाशल्यक ऊतक के उपयोग के लिए सभी मामलों में प्राप्त किया गया था ।

1. मीडिया और रिएजेंट की तैयारी (तालिका 1)

नोट: समाधान शुद्ध पानी है कि धातु और अंय अशुद्धियों का पता लगाने से मुक्त है में किया जाना चाहिए । यह अनुशंसित है कि समाधान प्रयोग के दिन नए सिरे से बनाया जाए, हालांकि अप्रयुक्त समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है, यदि वांछित हो । 1 एल के ऊपर प्रत्येक निर्माण के 1 – 2 टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रियाओं के लिए पर्याप्त है । सभी aCSF समाधान carbogen के साथ संतृप्त किया जाना चाहिए (९५% O2/5% CO2) से पहले स्थिर पीएच बफ़रिंग और पर्याप्त ऑक्सीजन सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने के लिए । सभी समाधानों का pH को समायोजित किया जाना चाहिए 7.3-7.4 और परासरणीयता मापा और समायोजित करने के लिए 300-310 mOsmol/kg ।

  1. तैयार NMDG-HEPES aCSF (मिमी में): ९२ NMDG, २.५ KCl, १.२५ णः2पीओ4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 ग्लूकोज, 2 thiourea, 5 न-ascorbate, 3 न-पाइरूवेट, ०.५ CaCl2· 2H2हे, व 10 MgSO4· 7H2o. अनुमापन pH ते ७.३ – ७.४ के साथ 17 मिलीलीटर +/-5 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड की ०.५ मिलीलीटर.
    नोट: यह अनुमापन कदम आदर्श रूप में वर्षण से बचने के लिए divalent cations के अलावा करने से पहले किया जाना चाहिए; हालांकि, वर्षा पीएच के शारीरिक सीमा के समायोजन पर उलट किया जा सकता है ।
  2. तैयार HEPES होल्डिंग aCSF (मिमी में): ९२ NaCl, २.५ KCl, १.२५ णः2पीओ4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 ग्लूकोज, 2 thiourea, 5 न-ascorbate, 3 न-पाइरूवेट, 2 CaCl2· 2H2o, व 2 MgSO4· 7H2o. अनुमापन केंद्रित 10 N NaOH की कई बूंदों के साथ 7.3-7.4 करने के लिए पीएच ।
  3. रिकॉर्डिंग aCSF तैयार (मिमी में): १२४ NaCl, २.५ KCl, १.२५ णः2पो4, 24 NaHCO3, १२.५ ग्लूकोज, 5 HEPES, 2 CaCl2· 2H2o, व 2 MgSO4· 7H2o. अनुमापन pH से 7.3-7.4 की कुछ बूंदें केंद्रित 10 एन NaOH ।
  4. तैयार ना+ कील-समाधान में (2 M): ५८० मिलीग्राम NaCl के 5 मिलीलीटर में भंग हौसले से तैयार NMDG-HEPES aCSF । यह एक मस्तिष्क टुकड़ा प्रस्तुत करने के लिए पर्याप्त समाधान है ।
  5. 2% agarose तैयार ऊतक embedding के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए । agarose प्रकार 1b के 2 जी भंग ( सामग्री की तालिकादेखें) 1x पंजाब और माइक्रोवेव के १०० मिलीलीटर में सिर्फ उबलते तक । भंवर मिश्रण करने के लिए, तो एक बाँझ 10 सेमी पेट्री बर्तन में मिश्रण डालना और जमना के लिए अनुमति देते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सील प्लास्टिक बैग में agarose प्लेट का उपयोग करें जब तक स्टोर ।
  6. इंजेक्शन संवेदनाहारी काम स्टॉक समाधान तैयार करें । 2-मिथाइल-2-ब्यूटानॉल के 5 मिलीलीटर के साथ 2, 2-Tribromoethanol के २.५ g को मिलाएं और फिर धीरे से २०० मिलीलीटर पंजाबियों में, पीएच 7.0 – 7.3 को भंग कर दें । उपयोग करने से पहले एक ०.२२ µm फिल्टर के साथ शेयर समाधान फ़िल्टर और 4 ° c प्रकाश से सुरक्षित पर स्टोर.
    नोट: संवेदनाहारी काम शेयर समाधान के लिए समय सीमा समाप्ति और निपटान की प्रक्रिया निर्धारित करने के लिए संबंधित पशु उपयोग समिति के दिशा निर्देशों और नियमों से परामर्श करें ।

2. टुकड़ा करने की क्रिया स्टेशन के सेटअप

  1. ऊतक स्लाइसर मशीन और शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ टुकड़ा करने की क्रिया स्टेशन सेट ( सामग्री की तालिकादेखें) । स्लाइसर मशीन जांचना, ब्लेड हाथ तेजी से चिपकने वाला गोंद का उपयोग करने के लिए एक zirconium सिरेमिक इंजेक्टर ब्लेड देते हैं, तो नमूना धारक डालने और नमूना धारक के लिए ब्लेड के अग्रणी धार संरेखित करने के लिए एक छोटे से अंतराल छोड़ने के ब्लेड नहीं परिमार्जन करता है रिम धातु ।
    नोट: यदि ब्लेड बढ़त शारीरिक रूप से क्षतिग्रस्त नहीं है यह कई हफ्तों या महीनों के लिए प्रतिस्थापन के बिना फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है । विभिन्न ऊतक स्लाइसर मॉडल वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हैं, जिनमें से कई उत्कृष्ट प्रदर्शन जब इष्टतम नपे प्रदान कर सकते हैं. आदर्श साधन न्यूनतम z-अक्ष झुकाव, या तो सीधे मापा और देखते या empirically मनाया जाना चाहिए.
  2. एक २५० मिलीलीटर NMDG के २०० मिलीलीटर-HEPES aCSF और पूर्व लगातार carbogenation के साथ बर्फ पर ठंड के साथ भरा चोंच सेट (एक गैस विसारक स्टोन के माध्यम से लागू मीडिया में डूबे) > 10 मिनट के लिए ।
    नोट: यह समाधान transcardial छिड़काव के लिए उपयोग किया जाएगा और अनुभाग के दौरान टुकड़ा करने की क्रिया मशीन जलाशय भरने के लिए ।
  3. प्रारंभिक मस्तिष्क टुकड़ा वसूली NMDG-HEPES aCSF के १५० मिलीलीटर (निरंतर carbogenation बनाए रखने) और एक गर्म पानी के स्नान में चैंबर जगह 32-34 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा के साथ भरा चैंबर की स्थापना की ।
    नोट: एडवर्ड्स और Konnerth (१९९२)५२ के डिज़ाइन के बाद एक स्लाइस चैंबर इस चरण के लिए अनुशंसित है । इन मंडलों को आसानी से उपलब्ध प्रयोगशाला मदों (२५० मिलीलीटर चोंच, नायलॉन जाल जाल, ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब, ३५ मिमी प्लास्टिक गोल पकवान) के साथ बनाया जा सकता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि टुकड़ा जाल हवा बुलबुले से मुक्त रहता है, विशेष रूप से लगातार carbogen गैस बुलबुला पत्थर द्वारा उत्पादित उन के रूप में इन स्लाइस को फ्लोट और क्षतिग्रस्त हो सकती है के लिए लिया जाना चाहिए । जाल लगभग तरल सतह के तहत 1 सेमी जलमग्न हो जाना चाहिए ।
  4. एक मस्तिष्क टुकड़ा पकड़े चैंबर सेट; एक बड़े जलाशय में कई स्वतंत्र कुओं के साथ एक डिजाइन की सिफारिश की है ( सामग्री की तालिकादेखें) । HEPES aCSF के ४५० मिलीलीटर के साथ जलाशय भरें और उपयोग तक लगातार carbogenation के तहत कमरे के तापमान को गर्म ।
    नोट: मस्तिष्क स्लाइसें electrophysiological रिकॉर्डिंग से पहले लंबी अवधि के भंडारण के लिए इस चैंबर के लिए प्रारंभिक वसूली कक्ष से स्थानांतरित किया जाएगा. ध्यान रखें कि टुकड़ा जाल हर समय हवा के बुलबुले से मुक्त रहता है सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए ।
  5. ऊतक embedding के लिए पिघला हुआ agarose तैयार करें । पहले से तैयार पकवान से 2% agarose के एक ब्लॉक में कटौती करने के लिए एक कुकी कटर की तरह एक ५० मिलीलीटर शंकु शीशी के खुले अंत का उपयोग करें । इस शंकु शीशी को ढीला कर टोपी, फिर 10 के लिए माइक्रोवेव-30 एस जब तक agarose बस पिघला है । ज़्यादा गरम मत करो ।
  6. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में पिघला हुआ agarose डालो । पिघला हुआ राज्य में agarose एक thermomixer सेट जोरदार झटकों के साथ ४२ डिग्री सेल्सियस के लिए का उपयोग कर बनाए रखें । ध्यान से सुनिश्चित करें कि पिघला हुआ agarose समय से पहले जमना नहीं है ।
  7. इस समय पूर्व-शांत करने के लिए बर्फ पर स्लाइसर के लिए गौण द्रुतशीतन ब्लॉक प्लेस ।

3. Transcardial छिड़काव

नोट: transcardial छिड़काव प्रक्रिया एक महत्वपूर्ण कदम है जब वयस्क जानवरों के साथ काम कर रहा है और मस्तिष्क के अर्क की तेजी से ठंडा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और कम न+, कम सीए2 +/high मिलीग्राम2 + aCSF के मस्तिष्क आधान के माध्यम से चयापचय धीमा समाधान. transcardial छिड़काव भी मस्तिष्क vasculature से लाल रक्त कोशिकाओं को साफ करने के लिए कार्य करता है, जो autofluorescence कम कर देता है कि दृश्य के साथ हस्तक्षेप और फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनों में सेल आबादी लेबल के लक्ष्यीकरण हो सकता है । यह transcardial छिड़काव चूकना उचित नहीं है ।

  1. गहराई से anesthetize चूहों संवेदनाहारी काम शेयर समाधान के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा (२५० मिलीग्राम/केजी: ०.२ एमएल के १.२५% संवेदनाहारी 10 ग्राम शरीर के वजन के प्रति शेयर समाधान काम कर रहा है, सामग्री की तालिकादेखें) । ~ 2-3 मिनट के बाद, पैर की अंगुली चुटकी पलटा का आकलन करके संज्ञाहरण के पर्याप्त गहराई सत्यापित करें । यदि आवश्यक हो, संवेदनाहारी काम कर रहे शेयर के एक अतिरिक्त मात्रा इंजेक्षन और एक और 2-3 मिनट के बाद पैर की अंगुली चुटकी पलटा पुनर्मूल्यांकन ।
  2. carbogenated NMDG के 25 मिलीलीटर के साथ एक 30 मिलीलीटर सिरिंज लोड-पूर्व ठंडा २५० मिलीलीटर चोंच से HEPES aCSF (2-4 डिग्री सेल्सियस इष्टतम है, के रूप में कीचड़ या जमे हुए समाधान का विरोध) । एक 25 5/8 गेज सुई लगायेंगे ।
  3. अपनी पीठ पर माउस के साथ, नीचे forepaws और स्थिरता के लिए हिंद पंजे पिन । एक 15 सेमी गिलास कठोर सिलिकॉन से भरा पेट्री डिश आधार के रूप में अच्छी तरह से काम करता है ।
  4. एक स्केलपेल का प्रयोग, एक पार्श्व चीरा डायाफ्राम के स्तर पर वक्ष गुहा खोलने के लिए बनाते हैं । ठीक कैंची का प्रयोग करें दोनों ओर पसली पिंजरे के माध्यम से काटने के लिए देखभाल लेने के लिए दिल और फेफड़ों कतरन से बचने के ।
  5. वापस रिब पिंजरे के केंद्र भाग पिन करने के लिए दिल का पर्दाफाश । बाईं निलय में 30 मिलीलीटर सिरिंज की सुई डालें और खून दिल से बाहर निकलने के लिए अनुमति देने के लिए ठीक कैंची के साथ सही atrium में कटौती ।
  6. दबाना सिरिंज मैनुअल लगातार दबाव का उपयोग कर गोताख़ोर और ठंडा NMDG के साथ पशु perfuse-HEPES aCSF की दर से ~ 10 मिलीलीटर/
    नोट: यदि छिड़काव सफल जिगर गहरे लाल रंग से पीली पीली करने के लिए बदल जाएगा, और कुछ मामलों में स्पष्ट तरल पदार्थ प्रक्रिया के अंत की ओर नाक से बाहर निकलते हुए देखा जा सकता है ।

4. मस्तिष्क विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया

  1. पशु को Decapitate । सिर पर त्वचा को खोलने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें और खोपड़ी टोपी बेनकाब ।
  2. खोपड़ी टोपी पर दूर त्वचा में कटौती और खोपड़ी के caudal/ventral आधार पर दोनों ओर बाद में छोटे चीरा बनाने के लिए ठीक सुपर कट कैंची का प्रयोग करें । अतिरिक्त उथले caudal/पृष्ठीय midline ऊपर rostral दिशा में जा खोपड़ी के पृष्ठीय पहलू पर शुरू करने की देखभाल के लिए अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान नहीं ले कटौती करते हैं । एक अंतिम ' टी कटौती घ्राण बल्ब के स्तर पर midline को सीधा काट कर ।
    ध्यान दें: देखभाल के लिए कोई क्षति सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र (ओं) के लिए किया जाता है । विशेष रूप से, कोई समय पर वहां किसी भी संपीड़न मस्तिष्क ही लागू बल होना चाहिए ।
  3. rostral-औसत दर्जे का पहलू पर शुरू खोपड़ी समझ और caudal पार्श्व दिशा की ओर वापस छील करने के लिए गोल टिप संदंश का प्रयोग करें । दोनों पक्षों के लिए दोहराएँ खोलने के लिए दरार और मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी टोपी के पृष्ठीय आधा हटाने. धीरे पूर्व ठंडा NMDG-HEPES aCSF के चोंच में बरकरार मस्तिष्क बाहर स्कूप । मस्तिष्क के लिए समान रूप से शांत ~ 1 मिनट की अनुमति दें ।
  4. दिमाग को यूरिन से बाहर निकालने के लिए और फिल्टर पेपर से ढके पेट्री डिश पर बड़े रंग का इस्तेमाल करें । ट्रिम कर दीजिए और ब्याज की टुकड़ा करने की क्रिया और वांछित मस्तिष्क क्षेत्र के पसंदीदा कोण के अनुसार मस्तिष्क ब्लॉक । निपटने के दौरान लंबे समय तक ऑक्सीजन अभाव से बचने के लिए जल्दी से काम करें ।
    नोट: कई टुकड़ा करने की क्रिया कोण संभव हो रहे हैं । सटीक अवरुद्ध विधि और टुकड़ा करने की क्रिया कोण सटीक मस्तिष्क क्षेत्र, सेल प्रकार, और सर्किट पर निर्भर करेगा का अध्ययन किया जाएगा ।
  5. चिपका चिपकने वाला गोंद का उपयोग कर नमूना धारक को मस्तिष्क ब्लॉक । पूरी तरह से अंदर मस्तिष्क ब्लॉक वापस लेने के लिए पर्याप्त नमूना धारक के भीतरी टुकड़ा मुकर । पिघला हुआ agarose सीधे धारक में डालो जब तक मस्तिष्क ब्लॉक पूरी तरह से agarose में शामिल है । agarose जम गया है जब तक ~ 10 एस के लिए नमूना धारक के आसपास पूर्व ठंडा गौण द्रुतशीतन ब्लॉक दबाना ।
  6. स्लाइसर मशीन पर संदूक में नमूना धारक डालें और उचित संरेखण सत्यापित करें । शेष पूर्व ठंडा के साथ जलाशय भरें, oxygenated NMDG-२५० मिलीलीटर चोंच से HEPES aCSF और पर्याप्त ऑक्सीजन सुनिश्चित करने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया की अवधि के लिए जलाशय में एक बुलबुला पत्थर ले जाएं ।
  7. agarose-एम्बेडेड मस्तिष्क नमूना आगे बढ़ना शुरू करने के लिए माइक्रोमीटर समायोजित करें । स्लाइसर प्रारंभ करें और empirically इच्छित स्तर पर उन्नत गति और दोलन आवृत्ति समायोजित ।
    नोट: दोनों सेटिंग्स निम्न श्रेणी में होना चाहिए । सर्वोत्तम परिणामों के लिए, ब्लेड बांह के एक एकल दर्रा लगभग 20 एस ले जाना चाहिए और दोलन कोई खुलकर गूंज के साथ एक बहुत ही चिकनी और कोमल गुनगुना शोर का उत्पादन करना चाहिए ।
  8. आगे बढ़ना जारी रखने और ३०० µm वेतन वृद्धि (या अंय पसंदीदा मोटाई) में ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया जब तक ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र पूरी तरह से खोदी है; टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के लिए कुल समय से कम 15 मिनट होना चाहिए ।

5. अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली प्रक्रिया

  1. प्रारंभिक NMDG पुनर्प्राप्ति चरण (महत्वपूर्ण चरण): अनुभागीकरण प्रक्रिया के पूरा होने पर, एक कट-ऑफ प्लास्टिक पाश्चर पाइप टी का उपयोग कर स्लाइस के सभी इकट्ठा और उंहें एक पूर्व गरम (३४ ° c) प्रारंभिक रिकवरी चैंबर के १५० मिलीलीटर से भरा में स्थानांतरण NMDG-HEPES aCSF । छोटे उत्तराधिकार में सभी स्लाइस स्थानांतरण और एक टाइमर शुरू के रूप में जल्द ही सभी स्लाइसें वसूली चैंबर में स्थानांतरित कर रहे हैं ।
  2. तालिका 2 से परामर्श इष्टतम ना+ स्पाइक-अनुसूची में माउस उंर के अनुसार निर्धारित करने के लिए ।
    नोट: इस प्रक्रिया को एक व्यावहारिक विधि है ना+ के पुन: आरंभ करने की एक नियंत्रित दर को प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क टुकड़ा चैंबर में और एक विशेष मस्तिष्क स्लाइस चैंबर ज्यामिति और जलाशय की मात्रा और प्रकार के लिए अनुकूलित है (देखें सामग्री की तालिका).
  3. संकेत दिया समय में ना+ स्पाइक-समाधान में संकेत दिया मात्रा जोड़कर stepwise na+ स्पाइक-प्रक्रिया में ले । Na+ कील-समाधान में सीधे प्रारंभिक वसूली चैंबर के चुलबुली चिमनी में तेजी से मिश्रण की सुविधा के लिए जोड़ें ।
  4. सभी स्लाइस को HEPES aCSF लंबी अवधि के होल्डिंग चैंबर में कमरे के तापमान पर बनाए रखा । स्लाइस को पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयोगों को प्रारंभ करने से पहले HEPES होल्डिंग चैंबर में एक अतिरिक्त 1 h के लिए पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें ।

6. पैच दबाना रिकॉर्डिंग

नोट: निम्नलिखित बुनियादी प्रक्रियाओं केवल कुछ व्यावहारिक विचार प्रदान करते हैं और पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करने के लिए इरादा नहीं कर रहे हैं, के रूप में ये कहीं और५३,५४पाया जा सकता है. एक पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग इस आवेदन के लिए आवश्यक है । यह आम तौर पर एक अवरक्त अवकलन हस्तक्षेप इसके विपरीत (IR-उद्योग) प्रकाशिकी और एक प्रतिदीप्ति रोशनी प्रणाली, एक पैच क्लैंप एम्पलीफायर और डेटा डिजिटलर, मोटर micromanipulator और माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित एक ईमानदार माइक्रोस्कोप की रचना की जाएगी मंच, कंपन अलगाव तालिका, फैराडे पिंजरे, और समाधान हीटिंग और छिड़काव प्रणाली । नमूना चैंबर और मंच जलमग्न टुकड़ा रिकॉर्डिंग के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए । बहु-न्यूरॉन पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए, कई एम्पलीफायरों, सिर चरणों, और उच्च गुणवत्ता micromanipulators के साथ सुसज्जित एक रिग की आवश्यकता है । इसके अलावा, सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक रिग एक ९०० एनएम आईआर बैंड पास फिल्टर और मिलान ऑप्टिकल घटकों के साथ सुसज्जित है उच्च मस्तिष्क स्लाइस में > 50 µm स्थित कोशिकाओं की पर्याप्त दृश्य सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है. Kӧhler रोशनी के लिए उचित संरेखण स्पष्ट दृश्य के लिए भी महत्वपूर्ण है ।

  1. तैयार intracellular पिपेट समाधान (मिमी में): १३० K-Gluconate, 4 KCl, 10 HEPES, ०.३ EGTA, 10 phosphocreatine-ना2, 4 MgATP, ०.३ ना2-GTP, और १३.४ biocytin. 1 M KOH और परासरणीयता के साथ ७.३५ करने के लिए पीएच समायोजित करने के लिए 285 – 290 mOsmol/kg सुक्रोज का उपयोग आवश्यकतानुसार ।
  2. मोटी घिरी borosilicate ग्लास केशिकाओं से पैच क्लैंप इलेक्ट्रोड तैयार; आदर्श पैच क्लैंप इलेक्ट्रोड एक ~ 3-6 स्नान में MOhm भरा टिप प्रतिरोध के साथ एक अपेक्षाकृत कम और कड़ों शंकु है ।
  3. सुनिश्चित करें कि स्थिर रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए सिल्वर इलेक्ट्रोड तारों को ठीक से क्लोराइड है । इस (ठेठ) तरल ब्लीच में चांदी के तार के पिछले 3-4 मिमी लगभग 30 मिनट या जब तक तार काला हो जाता है को विलय करके ।
  4. समाधान छिड़काव स्थापित करने के लिए एक सिकुड़नेवाला पंप सेट का उपयोग कर 3-4 मिलीलीटर/ओवरफ़्लो से बचने के लिए बहिर्वाह और बहिर्वाह से मेल करने के लिए रिकॉर्डिंग चैंबर के माध्यम से carbogenated रिकॉर्डिंग aCSF परिचालित ।
  5. डुबकी रिकॉर्डिंग चैंबर में एक एकल मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरण और जगह में सुरक्षित नायलॉन पार तार के साथ एक यू के आकार का टुकड़ा लंगर का उपयोग कर । एक उच्च शक्ति उद्देश्य के लिए स्विचन से पहले एक 4x हवा उद्देश्य का उपयोग कर लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान (उदा, उच्च संख्यात्मक एपर्चर 40X या 60X जल विसर्जन उद्देश्यों) ।
  6. नेत्रहीन एक स्वस्थ लक्ष्य सेल की पहचान । सोमा पर न्यूरॉन झिल्ली की उपस्थिति, के रूप में IR-उद्योग माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized, पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक उंमीदवार सेल की उपयुक्तता ंयायाधीश के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    नोट: स्वस्थ ंयूरॉंस आमतौर पर निंनलिखित सुविधाओं का प्रदर्शन: न तो सिकुड़ा और न ही सूजन सोमता, झिल्ली किनारों के नरम विपरीत, और चिकनी झिल्ली उपस्थिति । इसके अलावा, स्वस्थ कोशिकाओं के बहुमत स्थित हैं > 30 µm गहरी टुकड़ा में, के रूप में सतही न्यूरॉन्स गंभीर वृक्ष प्रक्रियाओं के साथ क्षतिग्रस्त होने की संभावना है. न्यूरॉन्स कि एक crinkled उपस्थिति का प्रदर्शन, स्पष्ट रूप से दिखाई नाभिक या ' तला हुआ अंडा ' उपस्थिति, या बहुत अंधेरे या उच्च कंट्रास्ट झिल्ली किनारों से बचा जाना चाहिए.
  7. वापस-intracellular समाधान के ~ 5 µ l के साथ पैच पिपेट भरें और इलेक्ट्रोड धारक पर लोड । मस्तिष्क टुकड़ा ऊपर रिकॉर्डिंग स्नान में पिपेट हटो और प्रकाश सकारात्मक दबाव टिप में किसी भी अवरोधों को साफ करने के लिए लागू होते हैं । शूंय पिपेट ऑफसेट और एक झिल्ली परीक्षण समारोह का उपयोग टिप प्रतिरोध की निगरानी ।
  8. लक्ष्य ंयूरॉन के सेल शरीर के साथ संपर्क में पिपेट टिप ले जाएं; एक छोटी सी डिंपल प्रकाश सकारात्मक दबाव के कारण झिल्ली की सतह पर फार्म चाहिए ।
  9. जैसे ही एक झिल्ली डिंपल मनाया जाता है, तेजी से सकारात्मक दबाव को दूर करने और सील गठन की सुविधा के लिए कोमल चूषण लागू होते हैं । एक बार पिपेट प्रतिरोध बढ़ जाती है करने के लिए > 100 MOhm, एक होल्डिंग कमांड पर बारी करने के लिए एक स्तर है कि प्रत्याशित आराम झिल्ली लक्षित सेल प्रकार (-७० एमवी एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है) के लिए क्षमता से मेल खाता है ।
  10. एक बार टिप प्रतिरोध ≥ 1 gigaohm तक पहुँचता है, पैच के नीचे झिल्ली rupturing द्वारा कोशिका में तोड़ने के लिए प्रयास पिपेट तीव्र चूषण का संक्षिप्त डटकर उपयोग; ' जैप ' सुविधा को तोड़ने की सुविधा के रूप में की जरूरत का उपयोग किया जा सकता है ।
    नोट: की एक होल्डिंग क्षमता-७० एमवी cortical ंयूरॉंस पर वोल्टेज दबाना प्रयोगों के लिए सुझाव दिया है । स्वस्थ ंयूरॉंस एक रिसाव वर्तमान कोई और अधिक नकारात्मक प्रयोग की अवधि के लिए-१०० pA होगा, लेकिन इस भाग में सेल प्रकार पर निर्भर है । एक ंयूरॉन विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा अगर आराम झिल्ली की क्षमता अधिक-५० एमवी, या अगर उपयोग प्रतिरोध से अधिक 20% से बदल गया था ।
  11. एक बार एक स्थिर पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त की है, के लिए लक्ष्य अतिरिक्त ंयूरॉंस कदम दोहराने से रिकॉर्डिंग के लिए 6.6-6.10 । यांत्रिक गड़बड़ी है कि पहली रिकॉर्डिंग खोने में परिणाम होगा से बचने के लिए ध्यान रखना ।
    1. का चयन करें अतिरिक्त ंयूरॉंस के भीतर १०० µm से पहले ंयूरॉन को सुनिश्चित करने के लिए एक उचित संभावना synaptically-युग्मित ंयूरॉंस ।
      नोट: यह पहले पैच दबाना रिकॉर्डिंग स्थापित करने से पहले विभिन्न लक्षित कोशिकाओं के पास सभी पिपेट आसपास के सामने और पूर्व लोड और पूर्व स्थिति के लिए कई उंमीदवार ंयूरॉंस की पहचान करने के लिए कुछ मामलों में सहायक हो सकता है ।

Representative Results

यह खंड नियमित रूप से मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि का उपयोग कर प्रयोगों के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है (यानी, NMDG सुरक्षात्मक वसूली क्रमिक ना के साथ संयुक्त+ स्पाइक-प्रक्रिया में) । सबसे पहले, न्यूरॉन्स के रूपात्मक संरक्षण मस्तिष्क स्लाइस के साथ या अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि को लागू करने के बिना तैयार की विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में मूल्यांकन किया गया था (चित्रा 1). तीन महीने पुराने वयस्क चूहों इन प्रयोगों के लिए चयन किया गया था, और हम सोमता और समीपस्थ dendrites के आकार और समग्र उपस्थिति के आधार पर ंयूरॉन स्वास्थ्य का निर्धारण करने के लिए IR-उद्योग माइक्रोस्कोपी का उपयोग । shriveled, मस्तिष्क सुरक्षात्मक वसूली विधि के बिना तैयार स्लाइस के प्रतिनिधि छवियों में सबसे न्यूरॉन्स के pyknotic उपस्थिति (सभी छवियों को प्राप्त किया गया 1 – टुकड़ा तैयारी के बाद 2 ज). इन नियंत्रण स्लाइस transcardial छिड़काव और टुकड़ा करने की क्रिया कदम के लिए NMDG aCSF का उपयोग कर तैयार किया गया था लेकिन शुरू में उच्च ना+-HEPES aCSF युक्त में बरामद किया गया । इसके विपरीत, स्लाइस से प्रतिनिधि छवियों अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि का उपयोग कर तैयार सुधार morphologies के साथ न्यूरॉन्स प्रकट (चिकनी, फुलर, कम crinkled उपस्थिति) कि पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हैं (चित्रा 1). सुधारित न्यूरॉन संरक्षण neocortical परतों द्वितीय/III और वी, subiculum, और पृष्ठीय पार्श्व geniculate नाभिक (dLGN) सहित कई मस्तिष्क क्षेत्रों में मनाया गया.

अगले, अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि मूल NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि (यानी, क्रमिक ना+ स्पाइक-प्रक्रिया में) के बिना की तुलना में था । पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयास में gigaohm सील गठन के लिए औसत समय नाटकीय रूप से और काफी कम था (९.९ एस बनाम ३३.३ एस, * *p < 0.005, युग्मित टी-टेस्ट) जब क्रमिक ना+ स्पाइक में प्रक्रिया लागू किया गया था NMDG सुरक्षात्मक वसूली कदम (चित्रा 2) के साथ एक साथ । तेजी से और अधिक विश्वसनीय झिल्ली सील बार काफी युवा वयस्क मस्तिष्क स्लाइस में पैच दबाना रिकॉर्डिंग के प्रवाह में सुधार । इष्टतम एनए+ स्पाइक-अनुसूची में आगे पशु उंर (तालिका 2) के अनुसार संशोधित किया गया था और सभी उंर के लिए लाभकारी (3 सप्ताह के लिए 1 वर्ष पुराने चूहों) का परीक्षण किया गया । स्पाइक के पाठ्यक्रम में क्रमिक सोडियम आयन एकाग्रता ऊंचाई की प्रोफाइल-प्रक्रिया में प्रदान की जाती है (चित्रा 3) तालिका 2में दिखाए गए कार्यक्रम के साथ.

एलन संस्थान के भाग के रूप में सेल प्रकार के कार्यक्रम (http://celltypes.brain-map.org/) एक बड़े पैमाने पर प्रयास को व्यवस्थित करने के लिए युवा वयस्क में व्यक्तिगत ंयूरॉंस की आंतरिक electrophysiological गुण विशेषता चल रहा है (जन्मोत्तर दिवस 40-80) माउस दृश्य cortical मस्तिष्क ट्रांसजेनिक लाइनों से सेल प्रकार के साथ व्युत्पंन-विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर अभिव्यक्ति आनुवंशिक रूप से परिभाषित ंयूरॉंस आबादी में (cortical परत और कोशिका प्रकार विशिष्ट Cre चालक लाइनों एक Cre निर्भर फ्लोरोसेंट को पार रिपोर्टर लाइन५५) । चित्रा 4 Parvalbumin (Pvalb) से रिकॉर्ड फायरिंग पैटर्न के उदाहरण अंश से पता चलता है-व्यक्त cortical फास्ट-spiking (FS) न्यूरॉन्स (Pvalb-आयरेस-Cre/Ai14 चूहों) की एक श्रृंखला के जवाब में 1 एस वर्तमान इंजेक्शन कदम है कि गतिशील रेंज के कवर न्यूरॉन ने फायरिंग की । F-I वक्र एक dataset के लिए 22 cortical FS न्यूरॉन्स दाईं ओर दिखाया गया है । समान लक्षित पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयोगों Rorb-आयरेस-Cre/Ai14 चूहों (चित्रा 4) से लेयर चतुर्थ में 23 Rorb-एक्सप्रेस उत्तेजक न्यूरॉन्स की विशेषता के लिए प्रदर्शन किया गया. cortical क्षेत्रों और परतों भर में एफएस न्यूरॉन्स और पिरामिड न्यूरॉन्स सहित विविध स्वस्थ ंयूरॉन प्रकार नियमित रूप से कर सकते हैं और मज़बूती से इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग कर टुकड़ा तैयारी के बाद कम से 6-8 ज के लिए पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित किया जा सकता है ।

आंतरिक न्यूरॉन गुणों को मापने के अलावा, synaptic कनेक्टिविटी दृश्य cortical microcircuits में परिभाषित प्रकार के एक साथ कई दर्ज न्यूरॉन्स के बीच जांच की गई थी. बहु-ंयूरॉन पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीक असाधारण मांग है, के रूप में परिभाषित प्रकार के कई स्वस्थ उंमीदवार ंयूरॉंस के भीतर मौजूद होना चाहिए मस्तिष्क टुकड़ा के एक अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्र में आदेश उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने का एक उचित मौका सुनिश्चित करने के लिए एक साथ रिकॉर्डिंग और बोना synaptic कनेक्शन की पहचान । चित्रा 5 से पता चलता है दो tdTomato + एफएस न्यूरॉन्स के दृश्य प्रांतस्था में युवा वयस्क Pvalb-आयरेस-Cre/Ai14 चूहों से व्युत्पंन मस्तिष्क स्लाइस के युग्मित रिकॉर्डिंग । एक मजबूत एकतरफ़ा निरोधात्मक synaptic कनेक्शन का पता लगाया गया था (उच्च क्लोराइड आंतरिक पिपेट समाधान के साथ दर्ज) । उदाहरण रिकॉर्डिंग और अल्पकालिक synaptic प्लास्टिक के गुणों को मापने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं । उच्च आवृत्ति ट्रेन उत्तेजना (10, ५०, और १०० हर्ट्ज पर प्रत्येक 10 दालों) विभिन्न समय अंतराल (1, 2, या 4 एस) पर एकल वसूली परीक्षण दालों के द्वारा पीछा किया गया synaptic अवसाद से वसूली के समय पाठ्यक्रम को मापने के लिए डटकर ।

उत्कृष्ट सफलता भी परिपक्व वयस्क पूर्व vivo मस्तिष्क स्लाइसें में मानव neocortical ंयूरॉंस के लिए प्राप्त किया गया है । तंत्रिकाशल्यक नमूनों स्थानीय अस्पतालों में ट्यूमर हटाने के लिए अनुसूचित सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त कर रहे हैं । मानव तंत्रिकाशल्यक ऊतक संग्रह और मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के लिए प्रक्रियाओं कुछ व्यावहारिक तरीके में माउस मस्तिष्क टुकड़ा प्रक्रियाओं से अलग. संक्षेप में, reneocortical ऊतक (पैथोलॉजी साइट के लिए बाहर) ऑपरेटिंग कमरे से एकत्र की है और बर्फ ठंडा oxygenated NMDG-HEPES aCSF में डूबे और ऑपरेटिंग कमरे से लगातार द्रुतशीतन और ऑक्सीजन के साथ ले जाया जाता है प्रयोगशाला 30 मिनट या उससे कम के भीतर । मस्तिष्क स्लाइसें NMDG सुरक्षात्मक वसूली प्रक्रिया का उपयोग कर तैयार कर रहे है और पैच दबाना रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले लगभग 3 ज की एक विस्तारित समय के लिए ठीक करने की अनुमति दी । चित्रा 6 एक सफल युग्मित रिकॉर्डिंग प्रयोग और मानव पूर्व vivo मस्तिष्क के ललाट प्रांतस्था क्षेत्र से इस तरह से तैयार स्लाइस से एक सफल चौगुनी पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयोग से पता चलता है । युग्मित रिकॉर्डिंग एक cortical पिरामिड ंयूरॉन से एकतरफ़ा उत्तेजक synaptic इनपुट एक cortical न्यूरॉन पर प्रदर्शित करता है (उत्तेजक postsynaptic धाराओं के रूप में दर्ज). ट्रैक्टर पैच प्रयोग में दो उत्तेजक और दो निरोधात्मक न्यूरॉन्स एक साथ दर्ज किए गए थे, और तीन निरोधात्मक synaptic कनेक्शन का पता लगाया गया (निरोधात्मक postsynaptic क्षमता के रूप में दर्ज) बारह कुल कनेक्शन की जांच की । इस प्रकार, इस अनुकूलित मस्तिष्क स्लाइस पद्धति मस्तिष्क टुकड़ा अनुप्रयोगों के सबसे चुनौतीपूर्ण में विश्वसनीय प्रयोगात्मक सफलता की अनुमति देता है, बहु ंयूरॉन पैच दबाना प्रयोगों सहित तीव्र रूप से संप्रदाय परिपक्व वयस्क मानव मस्तिष्क में सर्किट कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए ऊतक.

figure-representative results-7064
चित्र 1: मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि के साथ बेहतर ंयूरॉन संरक्षण । प्रतिनिधि आईआर-डिक छवियों तीव्र स्लाइस में विविध मस्तिष्क क्षेत्रों से एक तीन महीने पुराने माउस से अधिग्रहीत किया गया । एक सुरक्षात्मक वसूली कदम (बाएं पैनलों) बनाम अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि (सही पैनलों) के बिना NMDG सुरक्षात्मक काटने विधि नियंत्रण । (क) लेयर वी ऑफ neocortex, (बी) लेयर II/III ऑफ neocortex, (C) subiculum, और (D) पृष्ठीय पार्श्व geniculate नाभिक (dLGN) । सभी पैनलों में स्केल बार्स 20 µm हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

figure-representative results-8000
चित्र 2: त्वरित गति और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग प्रयोगों में gigaohm सील गठन के सुधार की विश्वसनीयता न+ कील-प्रक्रिया में के साथ NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि का उपयोग कर । (क) NMDG वसूली अकेले (काले डेटा अंक, n = 19) बनाम NMDG वसूली प्लस ना+ स्पाइक-प्रक्रिया में (लाल डेटा अंक, n = 23) के लिए gigaohm सील गठन बार की साजिश । सभी दर्ज कोशिकाओं को परत द्वितीय में पिरामिड न्यूरॉन्स थे/III या दृश्य प्रांतस्था के वी । ध्यान दें, अधिक से अधिक समय १०० एस में छाया हुआ है कोशिकाओं है कि gigaohm जवानों का गठन कभी नहीं के लिए खाते । युग्मित t-परीक्षण, * *p < 0.005 । (ख) परत V पिरामिडीय न्यूरॉन्स के लिए आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) की साजिश (नारंगी डेटा अंक, n = 10/11), II/III हवामहल न्यूरॉन्स (हरे डेटा अंक, n = 9/10), या cortical Pvalb + एफएस न्यूरॉन्स (नीले डेटा अंक, एन = 23/22). ठोस हलकों NMDG वसूली हालत और खुले हलकों NMDG वसूली प्लस ना+ स्पाइक-प्रक्रिया में निरूपित । प्रत्येक डेटा बिंदु एक ंयूरॉन का प्रतिनिधित्व करता है और दोनों का मतलब है और +/-SEM प्रदर्शित कर रहे हैं । सभी तीन सेल प्रकार (युग्मित t-परीक्षण) के लिए मस्तिष्क स्लाइस तैयारी शर्तों की तुलना RMPs में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

figure-representative results-9545
चित्र 3 : स्पाइक के पाठ्यक्रम में क्रमिक सोडियम आयन एकाग्रता ऊंचाई के प्रोफाइल-प्रक्रिया में । (क) स्पाइक की साजिश-NaCl एकाग्रता में समय बनाम । (ख) कुल extracellular NaCl एकाग्रता बनाम समय का प्लाट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

figure-representative results-10134
चित्र 4 : आनुवंशिक रूप से परिभाषित cortical कोशिका प्रकार के आंतरिक electrophysiological गुण. (एक) Pvalb के लिए वर्तमान इंजेक्शन चरणों के जवाब में न्यूरॉन फायरिंग के उदाहरण निशान + cortical एफएस न्यूरॉन्स (बाएँ पैनल). tdTomato + न्यूरॉन्स Pvalb-आयरेस-Cre/Ai14 चूहों से मस्तिष्क स्लाइस में रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित किया गया. सारांश डेटा के लिए फायरिंग दर-वर्तमान इंजेक्शन संबंध (F-I वक्र) दाएँ (n = 22) पर दिखाए जाते हैं । (ख) Rorb-एक्सप्रेस cortical लेयर IV उत्तेजक न्यूरॉन्स (बाएं पैनल) के लिए वर्तमान इंजेक्शन चरणों के जवाब में न्यूरॉन फायरिंग के उदाहरण अंश. tdTomato + न्यूरॉन्स Rorb-आयरेस-Cre/Ai14 चूहों से मस्तिष्क स्लाइस में रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित किया गया. गोलीबारी दर-वर्तमान इंजेक्शन संबंध (F-I वक्र) के लिए सारांश डेटा दाएँ (n = 23) पर दिखाए जाते हैं । प्रत्येक पतली रंग की रेखा एक ंयूरॉन के लिए एफ मैं वक्र का प्रतिनिधित्व करता है; जबकि, मोटी काली लाइनें प्रत्येक समूह के लिए औसत का प्रतिनिधित्व करता है +/-SEM. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

figure-representative results-11448
चित्र 5: synaptically में अल्पकालिक प्लास्टिक Pvalb-एक्सप्रेस cortical एफएस न्यूरॉन्स जुड़े । (A) अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट और epifluorescence माउस प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था के tdTomato-धनात्मक, Pvalb-express FS ंयूरॉंस को लक्षित करने के लिए उपयोग किया गया । एक रंग कोडित योजनाबद्ध कनेक्टिविटी दो न्यूरॉन्स के बीच एक एकतरफा synaptic कनेक्शन का प्रदर्शन आरेख. (B) उत्तेजना प्रोटोकॉल के synaptically-कनेक्टेड न्यूरॉन्स की अल्पकालिक गतिशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया । 10 कार्रवाई क्षमता की गाड़ियों (10, ५०, और १०० हर्ट्ज) presynaptic ंयूरॉन में पैदा कर रहे हैं, एक ही कार्रवाई की क्षमता (वसूली टेस्ट पल्स, RTP) अलग समय देरी के साथ दिया (1, 2, और 4 एस) के बाद ट्रेन समाप्त हो गया है । प्रत्येक RTP रंग स्पष्टता के लिए कोडित रहे हैं । (ग) कोशिका #1 में पैदा होने वाली कार्रवाई संभावितों की गाड़ियों के जवाब में इसी एकतरफा निरोधात्मक पोस्ट-synaptic क्षमता (uIPSPs) की सेल #2 में औसत निशान । ग्रे इनसेट uIPSP ट्रेन के विरेखांकन दिखाने के लिए समय पैमाने पर विस्तार किया गया है । (D) सामान्यीकृत uIPSP आयाम अलग आवृत्तियों पर गाड़ियों के दौरान उनकी स्थिति के एक समारोह के रूप में रची जाती हैं । नेट डिप्रेशन सभी इनपुट दरों में uIPSP की एक पर्याप्त वसूली के साथ स्पष्ट है 4 एस. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

figure-representative results-13038
चित्र 6: वयस्क मानव तंत्रिकाशल्यक मस्तिष्क स्लाइस में मल्टी-न्यूरॉन पैच दबाना रिकॉर्डिंग. (A) निंन और उच्च आवर्धन IR-शब्दकोश दर्ज ंयूरॉंस (शीर्ष पैनलों) के स्थान और पहचान का संकेत छवियां । एक पिरामिडीय न्यूरॉन (काले तारे) और पड़ोसी न्यूरॉन (लाल तारे) एक साथ दर्ज किए गए. उदाहरण के रंग कोडित एक एकतरफ़ा उत्तेजक synaptic कनेक्शन के निशान (ESPC) के पिरामिड कोशिका से ंयूरॉन करने के लिए (वोल्टेज दबाना में EPSCs के रूप में मापा) और इसी भौतिक कनेक्शन नक्शा (नीचे पैनलों) । (ख) dorsolateral आकडे प्रांतस्था के एक वयस्क मानव तंत्रिकाशल्यक मस्तिष्क स्लाइस में चौगुनी पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयोग । दो पिरामिडीय न्यूरॉन्स और दो न्यूरॉन्स एक साथ दर्ज कर रहे हैं, बारह संभव synaptic कनेक्शन की अनुक्रमिक जांच के लिए अनुमति देता है. सेल #3 (हरे निशान) में निरोधात्मक पोस्ट का पता लगाने के लिए नेतृत्व में कार्रवाई संभावितों की एक ट्रेन-synaptic क्षमता (IPSPs) अन्य तीन एक साथ एक साथ दर्ज न्यूरॉन्स (तीन बॉक्स्ड क्षेत्रों, शीर्ष पैनलों) में से प्रत्येक में. प्रत्येक व्यक्ति ंयूरॉन से दर्ज की प्रतिक्रियाएं रंग स्पष्टता के लिए कोडित रहे हैं । शारीरिक कनेक्शन नक्शा नीचे पैनल में दिखाया गया है । नोट (B) में दिखाए गए अपुष्ट अंश औसत रूप से ंयूनतम 20 अपुष्ट डेटा राज्यभर के प्रतिनिधित्व करते हैं । सेल प्रकार की ख्यात पहचान सोमा आकार पर आधारित थी, रिकॉर्डिंग के दौरान फ्लोरोसेंट डाई भरने के द्वारा आकृति विज्ञान का विश्लेषण, और वर्तमान इंजेक्शन चरणों के जवाब में गोलीबारी पैटर्न सहित आंतरिक electrophysiological गुण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

NMDG-HEPES aCSFHEPES होल्डिंग aCSFरिकॉर्डिंग aCSF
घटकमिमीमेगावाटg/लीटरमिमीमेगावाटg/लीटरमिमीमेगावाटg/लीटर
NMDG९२१९५.२२१७.९६
एचसीएल९२३६.४६*
nacl९२५८.४४५.३८१२४५८.४४७.२५
kcl२.५७४.५५०.१९२.५७४.५५०.१९२.५७४.५५०.१९
णः2पो4 १.२१३८.०००.१७१.२१३८.०००.१७१.२१३८.०००.१७
NaHCO3 30८४.०१२.५२30८४.०१२.५२24८४.०१२.०२
HEPES20२३८.३१४.७७20२३८.३१४.७७5२३८.३११.१९
ग्लूकोज25१८०.२०४.५१25१८०.२०४.५११२.५१८०.२०२.२५
सोडियम ascorbate5१९८.०००.९९5१९८.०००.९९0१९८.०००.००
Thiourea2७६.१२०.१५2७६.१२०.१५0७६.१२०.००
सोडियम पाइरूवेट3११०.०४०.३३3११०.०४०.३३0११०.०४०.००
MgSO४. 7H२O10२४६.४८5 मिलीलीटर2२४६.४८1 मिलीलीटर2२४६.४८1 मिलीलीटर (2 एम स्टॉक)
CaCl२. 2H२O०.५१४७.०१०.२५ एमएल2१४७.०१1 मिलीलीटर2१४७.०१1 मिलीलीटर (2 एम स्टॉक)
* अनुमापन pH का NMDG-HEPES aCSF to 7.3-7.4 केंद्रित एचसीएल का प्रयोग
सभी समाधान श्रेणी में होना चाहिए 300-310 mOsm/

तालिका 1: मीडिया योगों ।

पशु आयु
समय (min) *< 1 माह1-3 महीने 3-6 महीने 6-12 महीने 12 + महीने
0२५० µ l२५० µ l
1
2२५० µ l
3
4५०० µ l
5२५० µ l२५० µ l
6१००० µ l
7
8२००० µ l
9
10स्थानांतरण५०० µ l२५० µ l२५० µ l
11
12
13
14
15१००० µ l५०० µ l२५० µ l२५० µ l
16
17
18
19
20२००० µ l१००० µ l५०० µ l२५० µ l
21
22
23
24
25स्थानांतरण२००० µ l१००० µ l५०० µ l
26
27
28
29
30स्थानांतरण२,००० µ l१,००० µ l
31
३२
३३
३४
३५स्थानांतरण२,००० µ l
३६
३७
३८
३९
४०स्थानांतरण
* समय शूंय है पल स्लाइस प्रारंभिक वसूली चैंबर में स्थानांतरित कर रहे है

तालिका 2: क्रमिक ना के लिए अनुशंसित अनुसूची + स् पाइक-माउस उंर के अनुसार प्रक्रिया में ।

Discussion

ना + स् पाइक-में सुधार Gigaohm सील गठन और पैच दबाना रिकॉर्डिंग सफलता
NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि के प्रारंभिक संस्करण विशेष रूप से वयस्क और उम्र बढ़ने जानवरों2,5के लिए बनाया गया था । कुछ प्रारंभिक adopters भी किशोर पशु मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया (यानी, चूहों < 30 दिन पुरानी) के लिए इस पद्धति को लागू करने की मांग की है । हालांकि, यह उल्लेख किया गया है कि बकाया के विपरीत में नेत्रहीन-NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि के साथ न्यूरॉन संरक्षण की पुष्टि की इस आयु सीमा में, gigaohm सील गठन अक्सर बाहर स्टाल कर सकते हैं, विफल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयास करने के लिए अग्रणी. एक परिकल्पना है कि NMDG cations अधिक आसानी से किशोर मस्तिष्क स्लाइसें वयस्क मस्तिष्क स्लाइस के सापेक्ष में फंस रहे है और सील गठन में बाधा कर सकते हैं; हालांकि, gigaohm जवानों आसानी से फार्म कर सकते हैं, जबकि किशोर मस्तिष्क स्लाइस पूरी तरह से NMDG aCSF में डूब रहे है (नहीं दिखाया डेटा), इस प्रकार का संकेत है कि NMDG aCSF प्रति एसई gigaohm सील गठन बाधा नहीं है ।

प्रारंभिक मस्तिष्क टुकड़ा वसूली कदम के पूरा होने पर कम करने के लिए उच्च ना+ समाधान से तेजी से संक्रमण ंयूरॉन झिल्ली को नुकसान का कारण बनता है और सील गठन की प्रक्रिया perturbs । यह सहज रूप से दिया है कि कम से संक्रमण-उच्च ना+, ठंड से गर्म तापमान, और Ca के नाटकीय उन्नयन2 + मिलीग्राम के लिए2 + अनुपात सामूहिक रूप से सहज synaptic गतिविधि का एक विशाल पुनरुत्थान का नेतृत्व. मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया में इस निरोधात्मक रिबाउंड चरण एक कोरोनरी अपमान के बाद reperfusion चोट दर्पण की संभावना है । इस प्रकार, आगे प्रारंभिक वसूली चरण में एक क्रमिक ना+ स्पाइक-प्रक्रिया में न्यूरॉन झिल्ली क्षति को कम करने के लिए जो NMDG सुरक्षात्मक वसूली मशीन चैंबर में ना+ एकाग्रता की तरक्की में शामिल किया गया है धीरे और सटीक समय के साथ reproducibly उठाया । मूल सुरक्षात्मक वसूली प्रक्रिया के रूप में, तापमान और Ca से ना+ ऊंचाई के लौकिक पृथक्करण2 +/Mg2 + अनुपात ऊंचाई फायदेमंद है । लेकिन इसके अलावा, ना+ स्पाइक-प्रक्रिया में छोटे वृद्धिशील वृद्धि की ओर जाता है extracellular Na+ जल्दी समय अंक और देर से अंक की ओर बड़े बढ़ जाती है पर एकाग्रता, जिससे मस्तिष्क ऊतक वहन बेहतर करने के लिए ना+ स्तरों को समायोजित करने का अवसर । यह प्रक्रिया क्रमिक समाधान एक छिड़काव पंप या गुरुत्वाकर्षण ड्रिप लाइनों जो ना+ स्तर में लगातार बढ़ जाती है और दोनों बहिर्वाह और बहिर्वाह के लिए ध्यान देने की आवश्यकता के लिए स्लाइस चैंबर के ओवरफ्लो से बचने के लिए नेतृत्व द्वारा नियंत्रित करने के लिए एक विकल्प है । विशेष रूप से, यह ना+ में स्पाइक-प्रक्रिया में परासरणीयता स्लाइस चैंबर में समाधान का धीरे से पहले कई मिनट की अवधि में उगता है स्लाइसें सामांय परासरणीयता समाधान के लिए वापस आ रहे हैं, लेकिन यह प्रतिकूल स्लाइस स्वास्थ्य को प्रभावित नहीं किया या पैच दबाना सफलता रिकॉर्डिंग । एक उच्च परासरणीयता काटने समाधान पहले midbrain स्लाइस तैयारियों के लिए इस्तेमाल किया गया है के लिए बेहतर पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए डोपामाइन ंयूरॉंस की रक्षा के लिए५७,५८, इस प्रकार का प्रदर्शन है कि यह अस्थाई hyperosmolality कुछ संदर्भों में लाभकारी हो सकता है.

एक अनुकूलित प्रक्रिया को लागू करने के द्वारा NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि और क्रमिक ना+ स्पाइक-चरण में इस मस्तिष्क टुकड़ा पद्धति की उपयोगिता को परिपक्व वयस्क पशु उंर के माध्यम से जुवेनाइल कवर करने के लिए विस्तारित किया गया है । यह अद्यतन प्रोटोकॉल अब एक एकल इष्टतम NMDG aCSF निर्माण और प्रक्रिया का उपयोग कर पशु उम्र की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है । यदि आवश्यक हो, ना+ स्पाइक-प्रक्रिया में एक उत्तरोत्तर अब देरी और/या धीमी समय पाठ्यक्रम के साथ लागू किया जा सकता है पुराने जानवरों से मस्तिष्क स्लाइस की व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए, और हम अनुशंसित स्पाइक के एक बुनियादी गाइड प्रदान की है-कार्यक्रम में अनुसार पशु आयु के लिए ( तालिका 2देखें) । जबकि हम एक बुनियादी आवेदनों की एक विस्तृत सरणी के लिए उपयुक्त ढांचा प्रदान की है, अतिरिक्त उंनत कदम आगे बढ़ाने व्यवहार्यता और वयस्क और उंर बढ़ने जानवरों से मस्तिष्क के स्लाइस की लंबी उंर के लिए पता लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, glutathione बहाली रणनीतियों विशेष रूप से इस संबंध में प्रभावी रहे है और2,6कहीं वर्णित के रूप में लागू किया जा सकता है ।

चुनौतीपूर्ण प्रयोगों के लिए प्रवाह में सुधार
पैच दबाना रिकॉर्डिंग द्वारा synaptic कनेक्टिविटी का विश्लेषण एक मांग आवेदन है कि दोनों ंयूरॉन संरचना और समारोह के उत्कृष्ट संरक्षण की आवश्यकता है ताकि सफलता की एक उच्च विश्वसनीयता प्राप्त करने के लिए । न्यूरॉन्स की संख्या के रूप में एक साथ दर्ज किया जा करने के लिए रेखीय ऊपर चला जाता है, तकनीकी कठिनाई स्तर ऊपर अर्थ का उपसर्ग-रेखीय चला जाता है. वहां कई विफलता मोड रहे हैं, और विफलताओं का सबसे लगातार कारणों में से एक एक या एक से अधिक लक्षित कोशिकाओं पर पर्याप्त gigaohm जवानों फार्म करने में असमर्थता है । यह नाटकीय रूप से धीमी गति से प्रगति कर सकते हैं, विशेष रूप से जब तीन या अधिक न्यूरॉन्स एक साथ दर्ज किया जाना चाहिए. अनुकूलित NMDG सुरक्षात्मक वसूली विधि के साथ तेजी से gigaohm सील गठन के समय की खोज के अनुरूप है, दोनों वयस्क ट्रांसजेनिक के साथ सफलता की दर और बहु-ंयूरॉन पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रयोगों के प्रवाह में एक चिह्नित सुधार किया गया माउस मस्तिष्क स्लाइसें और वयस्क मानव तंत्रिकाशल्यक मस्तिष्क स्लाइसें । बेहतर दक्षता लगभग निश्चित रूप से दोनों और अधिक तेजी से और विश्वसनीय gigaohm सील गठन और इस प्रोटोकॉल के साथ स्लाइस के बेहतर ंयूरॉन संरक्षण के लिए कारण है । हालांकि इस प्रोटोकॉल पैच दबाना रिकॉर्डिंग अनुप्रयोगों के लिए स्पष्ट रूप से लाभ पर केंद्रित है, इसी तरह लाभ अन्य चुनौतीपूर्ण प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए अनुमानित कर रहे हैं, जहां मस्तिष्क स्लाइस व्यवहार्यता सर्वोपरि है ।

Acknowledgements

यह काम एलन इंस्टीट्यूट फॉर ब्रेन साइंस ने वित्त पोषित किया था । लेखक एलन संस्थान संस्थापकों, पॉल जी एलन और जोड़ी एलन शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, उनकी दृष्टि, प्रोत्साहन के लिए, और समर्थन करते हैं । हम भी पशु देखभाल, पशुपालन, और genotyping के प्रदर्शन के लिए एलन संस्थान तकनीकी सहायता स्टाफ धंयवाद ।

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Compresstome VF-200Precisionary InstrumentsVF-200Vibrating tissue slicer (recommended)
N-methyl-D-glucamineSigma AldrichM2004aCSF constituent
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014aCSF constituent
Potassium ChlorideSigma AldrichP5405aCSF constituent
Sodium Phosphate monobasic dihydrateSigma Aldrich71505aCSF constituent
Sodium BicarbonateSigma AldrichS5761aCSF constituent
HEPESSigma AldrichH4034aCSF constituent
GlucoseSigma AldrichG7021aCSF constituent
Sodium AscorbateSigma AldrichA4034aCSF constituent
ThioureaSigma AldrichT8656aCSF constituent
Sodium pyruvateSigma AldrichP5280aCSF constituent
Calcium chloride dihydrateSigma AldrichC7902aCSF constituent
Magnesium Sulfate heptahydrateSigma AldrichM1880aCSF constituent
2,2,2-Tribromoethanol Sigma AldrichT48402Anesthetic component 1
2-methyl-2-butanol Sigma Aldrich240486Anesthetic component 2
Curved blunt forcepsFine Science Tools11065-07Brain dissection tools
Fine dissecting scissors (supercut)Fine Science Tools14058-09Brain dissection tools
Large heavy duty scissors 7''Fine Science Tools14000-18Brain dissection tools
Metal spatulaSigma AldrichZ511455-1PAKBrain dissection tools
Razor bladesVWR89031-954Brain dissection tools
Brain Slice Keeper-4Automate ScientificS-BSK4brain slice holding chamber
nylon netting Warner Instruments64-0198For building small slice recovery chambers
Pyrex glass beakers (250 mL)VWR89090-434For building small slice recovery chambers
35 mm plastic dish, roundVWR100488-376For building small slice recovery chambers
Gas diffuser stones (10 µm)Sigma Aldrich59277For constant carbogenation (fine bubbles)
Agarose Type I-BSigma AldrichA0576For embedding brain specimens
Micro loader tipsEppendorf22491229For filling patch clamp electrodes
SylgardVWR102092-312For making a custom dissecting platform
Hydrochloric acid Sigma AldrichH1758-100MLFor pH adjustment of media
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich221465-25GFor pH adjustment of media
Potassium HydroxideSigma Aldrich221473For pH adjustment of media
Plastic transfer pipets 3 mL graduatedVWR89497-676For slice transfer
Zirconium ceramic injector bladesCadence Specialty BladesEF-INZ10http://cadenceinc.com/
KG-33 borosilicate glass capillary w/filamentKing Glass Companycustom quoteID: 0.87mm, OD 1.50mm
BiocytinSigma AldrichB4261Intern pipette solution
Phosphocreatine disodiumSigma AldrichP7936Intern pipette solution
Potassium GluconateSigma AldrichG4500-100GIntern pipette solution
EGTASigma AldrichE3889Intern pipette solution
Mg-ATPSigma AldrichA9187Intern pipette solution
Na2-GTPSigma Aldrich51120Intern pipette solution
sucroseSigma AldrichS0389Intern pipette solution
Heated water bath (2.5L)VWR13491-060Miscellaneous
Filter paper roundsVWR28456-022Miscellaneous
Cyanoacrylate glueAmazonB000BQRBO6Miscellaneous
Glass petri dishVWR89000-326Miscellaneous
10X Phosphate buffered salineSigma AldrichP5493Miscellaneous
30 mL syringesVWRBD302832Miscellaneous
1 mL syringesVWRBD-309628Miscellaneous
25 5/8 gauge needlesVWR89219-292Miscellaneous
Thermomixer (w/1.5 mL tube block)VWR89232-908To keep agarose molten 

References

  1. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  2. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  3. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  4. Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  5. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
  6. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
  7. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303 (3), 141-144 (2001).
  8. Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148 (4), 1004-1014 (2007).
  9. Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, 715-730 (1998).
  10. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  11. Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23 (2), 422-429 (2003).
  12. Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26 (41), 10461-10471 (2006).
  13. Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24 (27), 6228-6236 (2004).
  14. Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), 584-589 (2015).
  15. Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144 (2013).
  16. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  17. Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  18. Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31 (2), 265-270 (2015).
  19. LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
  20. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34 (29), 9506-9515 (2014).
  21. Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37 (7), 1154-1160 (2013).
  22. Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95 (1-2), 42-49 (2015).
  23. Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390 (2014).
  24. Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925 (2014).
  25. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. , (2015).
  26. Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32 (42), 14519-14531 (2012).
  27. McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8 (6), 1857-1869 (2014).
  28. Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18 (5), 728-735 (2015).
  29. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84 (3), 393-406 (2013).
  30. Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
  31. Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110 (3), 672-679 (2013).
  32. Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113 (1), 380-389 (2015).
  33. Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, 2799-2811 (2014).
  34. Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16 (12), 1764-1772 (2013).
  35. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  36. Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
  37. Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor's location. J Neurosci. 34 (9), 3253-3262 (2014).
  38. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034 (2012).
  39. Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, 3559-3576 (2014).
  40. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33 (48), 18792-18805 (2013).
  41. DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33 (4), 1486-1497 (2013).
  42. Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39 (1), 98-106 (2014).
  43. Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64 (3), 597-603 (2014).
  44. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  45. Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
  46. Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35 (2), 776-785 (2015).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501 (2014).
  49. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 9462 (2015).
  50. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9 (2), 323-336 (2014).
  51. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
  52. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
  53. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358 (2015).
  54. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
  55. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  56. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58 (6), 599-619 (1971).
  57. Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9 (7), 868-869 (2006).
  58. Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59 (2), 288-297 (2008).

Explore More Articles

NMDGsynapticneocortex

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved