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Este protocolo muestra la implementación de un optimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Una formulación de medios de comunicación solo se utiliza para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano de animales de cualquier edad y para diversas aplicaciones experimentales.
Este protocolo es una guía práctica para el N-metil-D-glucamine (NMDG) método de protección recuperación de preparación de corte de cerebro. Numerosos estudios recientes han validado la utilidad de este método para mejorar la preservación neuronal y viabilidad de rebanada de cerebro total. La aplicación de esta técnica por pioneros ha facilitado investigaciones detalladas en función cerebral utilizando diversas aplicaciones experimentales y que abarcan una amplia gama de edades animales, regiones del cerebro y tipos de la célula. Se describen los pasos para llevar a cabo la técnica de corte de cerebro protección recuperación utilizando una formulación de medios de comunicación de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) NMDG optimizada y un procedimiento mejorado para obtener confiablemente rebanadas de cerebro sano para electrofisiología de la abrazadera del remiendo. Con este enfoque actualizado, se observa una mejora sustancial en la velocidad y fiabilidad del gigaohm sello de formación durante la abrazadera del remiendo dirigido experimentos de grabación manteniendo excelente preservación neuronal, facilitando así un reto aplicaciones experimentales. Resultados representativos son siempre de la abrazadera del remiendo de la neurona de múltiples experimentos para ensayo de grabación conectividad sináptica en rebanadas de cerebro neocortical preparado a partir de ratones transgénicos adulto joven y madurados ejemplares adultos de Neurocirugía humanas. Además, el método de recuperación protección NMDG optimizado de corte de cerebro es compatible con animales juveniles y adultos, por lo tanto resolver una limitación de la metodología original. En Resumen, una sola formulación y procedimiento de corte de cerebro se pueden implementar a través de diversas especies y edades para lograr preservación excelente de la viabilidad y el tejido.
La preparación de rebanada cerebral aguda es un sistema esencial de modelo experimental en Neurociencia. Aproximadamente la mitad de un siglo, esta plataforma permite estudios dinámicos funcionales del cerebro vivo en una amplia variedad de especies animales y regiones anatómicas del cerebro. Si el uso es bioquímica, proyección de imagen funcional, morfología y electrofisiología, es de suma importancia para garantizar una óptima integridad y viabilidad de los tejidos en rodajas. Es por ello que la preparación de la rebanada del cerebro roedores juveniles altamente resistente (es decir, menores de día postnatal 30 para ratones) ha sido el preferido hasta la fecha. La dificultad en la obtención de cerebro suficientemente sano rebanadas de adulto maduro y crianza de animales ha demostrado para ser un desafío formidable para la mayoría y ha impuesto severas limitaciones para el estudio de la arquitectura funcional del cerebro maduro. Esto es particularmente cierto para la abrazadera del remiendo de grabación, una técnica que requiere preservación morfológica y funcional excelente y es indispensable para la caracterización detalladas propiedades intrínsecas y sinápticas de las neuronas individuales identificadas. Durante las últimas décadas, la gran mayoría de electrofisiólogos de abrazadera del remiendo se ha basado en un método de 'protección corte' utilizando sacarosa-sustituido bajo Na+ aCSF1 para la preparación de rodajas de cerebro sano de juvenil y en mucho menor medida, los animales adultos jóvenes. Este método se basa en la premisa que afluencia de Na+ pasiva y entrada de agua posterior y celular inflamación durante el paso de corte de la rebanada es el insulto predominante que lleva a la pobre supervivencia de las neuronas, particularmente para las neuronas ubicadas en la capas superficiales que son más propensos a mantener el trauma directo del movimiento de la hoja. Sin embargo, el método de corte protector todavía deja mucho que desear para la preparación de rebanada de cerebro de animales adultos maduros independientemente de la formulación particular aCSF implementado.
Una solución simple pero efectiva a este problema ha sido descrito2,3,4,5,6 y denomina el método de corte de cerebro 'protección recuperación'. La versión original de este método utiliza un aCSF NMDG-sustituido, NMDG fue identificado como el más versátil y efectivo entre varios otros candidatos sodio iones sustitutos (como sacarosa, glicerol, colina y Tris). La formulación de los medios de comunicación fue reforzada por la adición de HEPES para resistir el edema de la rebanada del cerebro y proporcionan más fuerte pH buffer7, así como la adición de suplementos para contrarrestar los efectos perjudiciales del estrés oxidativo (tabla 1). Se determinó empíricamente que una incubación de recuperación inicial en baja Na+, baja Ca2 +, y alto Mg2 + NMDG aCSF inmediatamente después de corte de tejido de cerebro adulto era necesario y suficiente para mejora neuronal conservación sobre una amplia gama de regiones cerebrales, tipos de células y animales edad3,5,6.
En particular, las encarnaciones anteriores de lo que ahora es llamado el método de recuperación protección pueden encontrarse en la literatura1,8,9,10,11,12, 13, aunque todo el potencial para maduros adultos y envejecimiento animal cerebro rebanada y parche abrazadera grabación no fue reconocida o demostrada en estos trabajos anteriores. Además, matizadas variaciones procesales siguen apareciendo en apoyo de aplicaciones experimentales4,14,15,16. El cuerpo colectivo de trabajo de estos numerosos grupos de investigación imparte alta confianza en la robustez del método de protección recuperación para la preservación de tejido mejorado. El método de recuperación protección NMDG ahora ha sido ampliamente adoptado y aplicado en numerosos estudios de investigación publicados utilizando preparaciones de rebanada de cerebro de animales adultos. Estos estudios de corte aguda palmo neocortical3,17,18, hipocampo15,19,20,21, estriado22 , 23 , 24, midbrain25,26,27,28,29y cerebelo30,31,32, 33 , regiones de 34 y una variedad de tipos de neurotransmisor y neuromodulador incluyendo glutamatérgica4,30, GABAérgico18,20,31,35 ,36, dopaminérgico24,29,37,38, colinérgicos14,37,38, 39, noradrenérgicas40y serotonergic27,28 neurotransmisión. El método está también bien adaptado para el control de optogenetic de la actividad neuronal en sectores derivados de animales transgénicos3,39 o siguiendo en vivo inyecciones virales17,27, 28,40,41,42,43, como bien como Ca2 + proyección de imagen funcional de la actividad neuronal2,44 ,45,46. Análisis de corto plazo plasticidad4,47,48 y diversas formas de plasticidad a largo plazo16,de35,48 han sido registrados. Un reciente estudio aplicó el método de recuperación protección NMDG para facilitar amplia y sistemática de sondeo de la conectividad sináptica en la corteza visual en rebanadas de cerebro de ratón adulto maduro usando el octopatch grabación configuración49 — un poderoso demostración de la utilidad y la robustez de este método. El método de recuperación protección incluso se ha aplicado con éxito en contextos experimentales previamente imprevistos, tales como, mejor preservación de la vasculatura y del pericitos en el cerebro cortical adulto rodajas50, abrazadera del remiendo de la grabación trasplantado las poblaciones interneurona en 1 a 1,5 años de Alzheimer ratón modelos20y un cerebro adulto rebanada del receptor tráfico ensayo51.
El siguiente protocolo describe los procedimientos paso a paso para implementar un método de protección recuperación NMDG optimizado de preparación de rebanada del cerebro para mejorar la viabilidad de las rebanadas de cerebro agudo. Se discuten los principios para la mejor preservación neuronal, así como la demostración de los beneficios claros de esta metodología para abrazadera de parche neurona múltiples complejos experimentos de grabación en rebanadas de cerebro de ratón transgénico adulto joven y adulto maduro rebanadas de cerebro humano neuroquirúrgica. El siguiente protocolo validado para ratones de 21 días de edad a más de un años de edad, así como por muestras neuroquirúrgicas humanas derivadas de pacientes adultos.
Procedimientos que involucran ratones transgénicos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Instituto Allen para la ciencia del cerebro. Machos y hembras ratones C57BL/6 (rango 10-30 g de peso) fueron utilizados en estos experimentos. Algunos de los resultados representativos describen datos obtenidos de rodajas de cerebro humano vivo. Muestras de tejido neocortical se obtuvieron durante neurocirugías para retiro del tumor. Fue necesario retirar el tejido neocortical sobrepuesto para acceder al tejido enfermo. Se obtuvo consentimiento informado del paciente en todos los casos para el uso del tejido neuroquirúrgico para fines de investigación bajo un protocolo aprobado por la Junta de revisión institucional del centro médico de sueco.
1. preparación de medios y reactivos (cuadro 1)
Nota: Soluciones deben hacerse para arriba en agua purificada libre de metales traza y otras impurezas. Se recomienda hacer soluciones recién en el día del experimento, aunque las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C hasta 1 semana, si lo desea. 1 L de cada formulación anterior es suficiente para los procedimientos de corte de 1-2. Todas las soluciones aCSF deben saturarse con carbogen (95% O25% CO2) antes de su uso para la amortiguación de pH estable y oxigenación adecuada. El pH de las soluciones debe ajustarse a 7.3-7.4 y la osmolalidad medida y ajustado a 300-310 mOsmol/kg.
2. configuración de la estación de corte
3. Transcardial perfusión
Nota: El procedimiento de perfusión de transcardial es un paso importante cuando se trabaja con animales adultos es importante para lograr un enfriamiento rápido del cerebro y ralentizado el metabolismo mediante infusión de cerebro de baja Na+, baja Ca2 +alta Mg2 + aCSF solución. La perfusión de transcardial también sirve para eliminar los glóbulos rojos de la vasculatura cerebral, que reduce la autofluorescencia que pudiera interferir con la visualización y focalización de las poblaciones de la célula fluorescente etiquetado en líneas transgénicas. No es recomendable omitir la perfusión transcardial.
4. disección y corte de cerebro
5. optimizado NMDG recuperación protección procedimiento
6. parche abrazadera grabación
Nota: Los siguientes procedimientos básicos simplemente proporcionan algunas consideraciones prácticas y no pretenden representar protocolos detallados para las grabaciones de la abrazadera del remiendo, como estos se pueden encontrar en otra parte53,54. Un aparejo de electrofisiología patch clamp se requiere para esta aplicación. Esto generalmente se compondrá de un microscopio vertical equipado con óptica de contraste (IR-DIC) infrarrojo interferencia diferencial y un sistema de iluminación de fluorescencia, un amplificador de la abrazadera del remiendo y digitalizador de datos, motorizados micromanipulador y microscopio plataforma de tabla de aislamiento de la vibración, jaula de Faraday y sistema de calefacción y de la perfusión de la solución. La cámara de la muestra y la plataforma deben estar diseñados para grabación rebanada sumergida. Para las grabaciones de la abrazadera del parche multi-neurona, se requiere una plataforma equipada con múltiples amplificadores, etapas de cabeza y micromanipuladores de alta calidad. Además, para obtener mejores resultados, una plataforma equipada con un filtro de paso de banda nm IR 900 y componentes ópticos que emparejan se recomienda para una visualización adecuada de las células ubicadas > 50 μm en las rebanadas de cerebro. La alineación apropiada para la iluminación de Kӧhler también es importante para una visualización clara.
Esta sección proporciona resultados representativos para la preparación de rebanada de cerebro rutinaria y experimentos de electrofisiología patch clamp utilizando el método de recuperación protección NMDG optimizado (es decir, NMDG protección recuperación combinada con gradual Na+ Spike en procedimiento). Preservación primera, morfológico de las neuronas se evaluó en diversas regiones del cerebro de rebanadas de cerebro preparados con o sin aplicar el método de recuperación protección NMDG optimizado (figura 1). Ratones adultos de tres meses fueron seleccionados para estos experimentos, y utilizamos microscopía IR-DIC para determinar salud neuronal basado en la forma y el aspecto general de los Somas y dendritas proximales. Tenga en cuenta el aspecto picnótico marchitas, de las neuronas la mayoría de las imágenes representativas de las rebanadas de cerebro preparados sin el método de recuperación protectora (todas las imágenes se obtuvieron 1 – 2 h después de la preparación de la rebanada). Estas rodajas de control fueron preparados utilizando NMDG aCSF para perfusión de transcardial y cortar pasos pero fueron inicialmente recuperados en alta Na+-que contienen HEPES aCSF. Por el contrario, las imágenes representativas de las rebanadas preparadas usando el método de recuperación protección optimizado de NMDG revelan las neuronas con morfologías mejorados (más suaves, más completa, menos apariencia arrugada) que son adecuados para la abrazadera del remiendo (figura la grabación 1). se observó la mayor preservación neuronal a través de múltiples regiones del cerebro incluyendo neocortical capas II/III y V, subiculum y el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN).
A continuación, el método de recuperación protección NMDG optimizado se comparó con NMDG recuperación protección método original (es decir, sin el gradual Na+ spike en procedimiento). El tiempo medio para la formación de sello gigaohm en abrazadera del remiendo intentos de grabación se redujo significativamente y de manera dramática (9,9 s versus 33.3 s, **p < 0.005, pares t-prueba) cuando se aplicó el gradual Na+ spike en procedimiento junto con el paso de la recuperación protección NMDG (figura 2). La membrana más rápida y más confiable sellado veces grandemente había mejorado el rendimiento de la abrazadera del remiendo en rebanadas de cerebro adulto joven. El óptimo Na+ spike en horario más fue modificado según la edad del animal (tabla 2) y fue beneficioso para todas las edades pruebas (de 3 semanas a ratones 1 años de edad). El perfil de elevación de concentración de ion sodio gradual en el transcurso del procedimiento de spike se ofrece (figura 3) para acompañar los horarios que se muestran en la tabla 2.
Como parte del programa de tipos de celular de Instituto de Allen (http://celltypes.brain-map.org/) un esfuerzo de gran escala está en marcha para sistemáticamente caracterizar las propiedades electrofisiológicas intrínsecas de neuronas individuales en adulto joven (40-80 de día postnatal) rebanadas de cerebro cortical visual ratón derivan de líneas transgénicas con expresión de marcador fluorescente tipo específico de célula en poblaciones neuronales genéticamente definidos (capa cortical y Cre líneas conductor cruzaron a un fluorescente de Cre-dependiente del tipo de la célula reportero de línea55). La figura 4 muestra huellas de ejemplo de los patrones de disparo de parvalbúmina (Pvalb)-expresar fast spiking corticales interneuronas de (FS) (ratones Pvalb-IRES-Cre/Ai14) en respuesta a una serie de 1 pasos de inyección actual s que cubren el rango dinámico de disparo de la neurona. El F-de la curva para un conjunto de datos de 22 interneuronas corticales de FS se muestra a la derecha. Similar objetivada se realizaron experimentos de grabación de abrazadera parche para caracterizar 23 neuronas excitatorias Rorb expresando en la capa IV de Rorb-IRES-Cre/Ai14 ratones (figura 4). Tipos de neurona sana diversos incluyendo interneuronas FS y neuronas piramidales en las capas y regiones corticales pueden rutinariamente y confiable dirigidos para grabar durante al menos 6-8 h después de rodaja preparación utilizando esta optimizado el protocolo de la abrazadera del remiendo.
Además de medir propiedades neuronales intrínsecas, fue sondeado conectividad sináptica entre las neuronas registradas simultáneamente múltiples de tipos definidos en microcircuitos corticales visuales. La abrazadera del remiendo de multi-neurona técnica de grabación es excepcionalmente exigente, como numerosas neuronas sanas candidato de tipos definidos deben estar presentes dentro de un campo relativamente pequeño de la rebanada del cerebro con el fin de asegurar una probabilidad razonable de obtener alta calidad grabaciones simultáneas y la identificación de conexiones sinápticas de bona fide . La figura 5 muestra pareada grabación de interneuronas del dos tdTomato + FS en la corteza visual de rebanadas cerebrales derivados de ratones adultos jóvenes de Pvalb-IRES-Cre/Ai14. Una fuerte conexión sináptica inhibitoria unidireccional fue detectada (grabado con solución de cloruro alta de interior de la pipeta). Se presentan registros de ejemplo y protocolos para medir propiedades de plasticidad sináptica a corto plazo. Peleas de la estimulación del tren de alta frecuencia (10 pulsos cada 10, 50 y 100 Hz) fueron seguidos por recuperación solo examen de los pulsos en diversos intervalos de tiempo (1, 2 o 4 s) para medir el curso del tiempo de recuperación de la depresión sináptica.
Excelente éxito también se ha obtenido para las neuronas neocorticales humanas en rebanadas de cerebro maduro adulto ex vivo . Neuroquirúrgicas muestras se obtienen de pacientes sometidos a cirugías programadas para la extracción del tumor en los hospitales locales. Los procedimientos para la preparación de tejidos humanos neuroquirúrgica colección y cerebro rebanada difieren de los procedimientos de rebanada del cerebro de ratón en algunos aspectos prácticos. En breve, tejido neocortical resecado (distal al sitio de la patología) se recoge de la sala de operaciones e inmerso en helada oxigenada NMDG HEPES aCSF y transportado con refrigeración continua y oxigenación de la sala de operaciones para la laboratorio dentro de 30 minutos o menos. Las rebanadas de cerebro son preparadas mediante el procedimiento de recuperación protección NMDG y permitió recuperar durante un tiempo prolongado de aproximadamente 3 h antes de iniciar grabaciones de patch clamp. La figura 6 muestra un acertado apareado grabación experimento y un experimento de grabación exitosa revisión cuádruple abrazadera de humanas ex vivo cerebro rebanadas preparadas en esta manera de la región de la corteza frontal. La grabación apareada muestra unidireccional entrada sináptica excitatoria de una neurona cortical piramidal sobre una interneurona cortical (registrado como corrientes postsinápticas excitatorias). En la versión cuádruple experimentar dos excitatorios y dos neuronas inhibitorias se registraron simultáneamente, y se detectaron tres conexiones sinápticas inhibitorias (registrado como potenciales inhibidores postsinápticos) de conexiones total doce sondeadas. Por lo tanto, esta metodología de corte de cerebro optimizado permite éxito experimental confiable en los más difíciles del cerebro rebanada aplicaciones, incluyendo múltiples neuronas parche abrazadera experimentos para estudiar la conectividad de circuito en el cerebro humano adulto maduro agudo resecado tejido.
Figura 1: Mejoró preservación neuronal con el método de recuperación protección NMDG optimizado de preparación de corte de cerebro. Se adquirieron imágenes representante IR-DIC de regiones diversas del cerebro en rebanadas agudos de un ratón de tres meses de edad. Método de corte protector NMDG sin un paso de recuperación protección (paneles de la izquierda) de control versus método de protección recuperación NMDG optimizado (paneles de la derecha). (A) capa V de corteza, (B) capa II/III de neocortex, subiculum (C) y (D) núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN). Barras de escala en todos los paneles son 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Acelerado velocidad y confiabilidad mejorada del gigaohm sellan formación en abrazadera del remiendo grabación experimentos utilizando el método de recuperación protección NMDG con procedimiento de spike Na+ . Parcela (A) de formación de sello gigaohm veces para la recuperación NMDG solo (negro los puntos de datos, números = 19) versus recuperación NMDG más Na+ spike en procedimiento (puntos rojo, números = 23). Todas las células registradas eran neuronas piramidales en la capa II/III o V de la corteza visual. Tenga en cuenta, el tiempo máximo se limita a 100 s para tener en cuenta las células que no formaron nunca sellos gigaohm. Junto t-test, **p < 0.005. (B) parcela de reposo potencial de membrana (RMP) de neuronas piramidales de la capa V (puntos naranja, números = 10/11), neuronas piramidales II/III (verde los puntos de datos, números = 9/10), o interneuronas corticales de Pvalb + FS (azul de puntos de datos, números = 23/22). Círculos sólidos denotan condición de recuperación NMDG y abren círculos NMDG recuperación plus Na+ spike-en procedimiento. Cada punto de datos representa una neurona y tanto la media y +/-SEM se muestran. No hay diferencias significativas en RMPs comparar condiciones de preparación de corte de cerebro para los tres tipos de células (emparejado t-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Perfil de elevación de concentración de ion sodio gradual en el curso del procedimiento en punto de. (A) parcela de spike en NaCl concentración frente al tiempo. (B) parcela de concentración extracelular total de NaCl versus tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Propiedades electrofisiológicas intrínsecas de tipos de la célula cortical definida genéticamente. Ejemplo de (A) traza de disparo neuronal en respuesta a los actuales pasos de inyección para Pvalb + cortical FS interneuronas (panel izquierdo). tdTomato + neuronas fueron objeto de grabaciones en rebanadas de cerebro de ratones Pvalb-IRES-Cre/Ai14. Datos de resumen para la cocción de relación de corriente de la tasa de inyección (F-de la curva) se muestran a la derecha (n = 22). En el ejemplo (B) se traza de disparo neuronal en respuesta a los actuales pasos de inyección para Rorb expresar capas corticales IV neuronas excitatorias (panel izquierdo). tdTomato + neuronas fueron objeto de grabaciones en rebanadas de cerebro de ratones Rorb-IRES-Cre/Ai14. Datos de resumen para la cocción de relación de corriente de la tasa de inyección (F-de la curva) se muestran a la derecha (n = 23). Cada línea delgada de color representa la F-de la curva de una sola neurona; mientras que las líneas negras gruesas representa la media para cada grupo +/-SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Plasticidad a corto plazo en interneuronas FS corticales expresando Pvalb synaptically conectadas. Contraste de interferencia diferencial (A) y epifluorescencia fueron utilizados tratar tdTomato-positivo, expresando Pvalb interneuronas de FS de la corteza visual primaria de ratón. Diagrama esquemático de conectividad demostrando una unilateral conexión sináptica entre las dos interneuronas había codificado por un color. (B) esquema de los protocolos de estimulación para evaluar la dinámica a corto plazo de las neuronas synaptically conectadas. Trenes de potenciales de acción 10 (10, 50 y 100 Hz) son evocados en la neurona presináptica, seguida por un solo potencial de acción (pulso de prueba de recuperación, RTP) entregado con retraso de tiempo diferentes (1, 2 y 4 s) después de que el tren ha terminado. Cada RTP son color cifrado para la claridad. (C) promedio rastros del correspondientes unilaterales inhibidores potenciales postsinápticos (uIPSPs) en la celda #2 en respuesta a los trenes de potenciales de acción evocados en la celda #1. Recuadro gris ha ampliado la escala de tiempo para mostrar el trazado del tren de uIPSP. (D) normalizado uIPSP amplitudes se trazan en función de su posición durante el entrena en diferentes frecuencias. Depresión neta es claro a través de tarifas de entrada todo con una recuperación sustancial de uIPSP en 4 s. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Grabaciones de abrazadera parche multi-neurona en humano adulto Neurocirugía cerebro cortes. (A) imágenes de alta y baja magnificación IR-DIC indicando la ubicación y la identidad de las neuronas registradas (paneles superiores). Una neurona piramidal (asterisco negro) y vecino interneurona (asterisco rojo) se registraron simultáneamente. Ejemplo color cifró los rastros de una conexión sináptica excitatoria unidireccional (ESPC) de células piramidales interneurona (medido como EPSCs en pinza de tensión) y el correspondiente mapa de conexión física (paneles inferiores). Experimento de grabación de abrazadera cuádruple parche (B) en una rebanada del cerebro neuroquirúrgica humano adulto del corteza prefrontal dorsolateral. Dos neuronas piramidales y dos interneuronas ha sido simultáneamente, permitiendo sondeo secuencial de doce posibles conexiones sinápticas. Un tren de potenciales de acción evocados en la celda #3 (rastros verdes) condujo a la detección de potenciales postsinápticos inhibitorios (IPSPs) en cada una de las otras neuronas simultáneamente registradas tres (tres regiones en caja, paneles superiores). Las respuestas de cada neurona individual son color cifrado para la claridad. En el panel inferior se muestra el mapa de conexión física. Tenga en cuenta los rastros crudos que se muestra en (B) representan los promedios de barridos de datos raw consecutivos por lo menos 20. Supuesta identificación del tipo de célula se basó en la forma del soma, análisis de la morfología de colorante fluorescente de relleno durante las grabaciones y propiedades electrofisiológicas intrínsecas incluyendo los patrones de disparo en respuesta a los pasos de inyección actual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
NMDG HEPES aCSF | HEPES holding aCSF | Grabación aCSF | |||||||
Componente | mM | MW | g/litro | mM | MW | g/litro | mM | MW | g/litro |
NMDG | 92 | 195.22 | 17.96 | ||||||
Ácido clorhídrico | 92 | 36,46 | * | ||||||
NaCl | 92 | 58.44 | 5,38 | 124 | 58.44 | 7.25 | |||
KCl | 2.5 | 74.55 | 0.19 | 2.5 | 74.55 | 0.19 | 2.5 | 74.55 | 0.19 |
NaH2PO4 | 1.2 | 138.00 | 0.17 | 1.2 | 138.00 | 0.17 | 1.2 | 138.00 | 0.17 |
NaHCO3 | 30 | 84.01 | 2.52 | 30 | 84.01 | 2.52 | 24 | 84.01 | 2.02 |
HEPES | 20 | 238.31 | 4.77 | 20 | 238.31 | 4.77 | 5 | 238.31 | 1.19 |
Glucosa | 25 | 180.20 | 4.51 | 25 | 180.20 | 4.51 | 12.5 | 180.20 | 2.25 |
ascorbato de sodio | 5 | 198.00 | 0.99 | 5 | 198.00 | 0.99 | 0 | 198.00 | 0.00 |
Tiourea | 2 | 76.12 | 0.15 | 2 | 76.12 | 0.15 | 0 | 76.12 | 0.00 |
piruvato de sodio | 3 | 110.04 | 0.33 | 3 | 110.04 | 0.33 | 0 | 110.04 | 0.00 |
MgSO4.7H2O | 10 | 246.48 | 5 mL | 2 | 246.48 | 1 mL | 2 | 246.48 | 1 mL existencia (2M) |
CaCl2.2 h2O | 0.5 | 147.01 | 0.25 mL | 2 | 147.01 | 1 mL | 2 | 147.01 | 1 mL existencia (2M) |
* valorar pH de HEPES NMDG aCSF a 7.3-7.4 con HCl concentrado | |||||||||
Todas las soluciones deben estar en el rango 300-310 mOsm/Kg |
Tabla 1: Formulaciones de medios de comunicación.
Animal edad | |||||
Tiempo (min) * | < 1 mes | 1-3 meses | 3–6 meses | 6–12 meses | 12 + meses |
0 | 250 ΜL | 250 ΜL | |||
1 | |||||
2 | 250 ΜL | ||||
3 | |||||
4 | 500 ΜL | ||||
5 | 250 ΜL | 250 ΜL | |||
6 | 1000 ΜL | ||||
7 | |||||
8 | 2000 ΜL | ||||
9 | |||||
10 | transferencia | 500 ΜL | 250 ΜL | 250 ΜL | |
11 | |||||
12 | |||||
13 | |||||
14 | |||||
15 | 1000 ΜL | 500 ΜL | 250 ΜL | 250 ΜL | |
16 | |||||
17 | |||||
18 | |||||
19 | |||||
20 | 2000 ΜL | 1000 ΜL | 500 ΜL | 250 ΜL | |
21 | |||||
22 | |||||
23 | |||||
24 | |||||
25 | transferencia | 2000 ΜL | 1000 ΜL | 500 ΜL | |
26 | |||||
27 | |||||
28 | |||||
29 | |||||
30 | transferencia | ΜL DE 2.000 | 1000 ΜL | ||
31 | |||||
32 | |||||
33 | |||||
34 | |||||
35 | transferencia | ΜL DE 2.000 | |||
36 | |||||
37 | |||||
38 | |||||
39 | |||||
40 | transferencia | ||||
* Hora cero es que las rodajas de momento son transferidas en la cámara de recuperación inicial |
Tabla 2: Horario recomendado para Na gradual + procedimiento de punto según la edad del ratón.
Na + Spike - mejora Gigaohm sello formación y éxito la grabación de la abrazadera del remiendo
La versión inicial del método de recuperación protección NMDG fue diseñada específicamente para animales adultos y envejecimiento2,5. Algunos pioneros también han intentado aplicar esta metodología a corte juvenil cerebro animal (es decir, ratones < 30 días de edad). Sin embargo, se ha observado que a diferencia de la excepcional confirmado visualmente neuronal preservación con el método de recuperación protección NMDG en este rango de edad, gigaohm sello formación puede frecuentemente puesto hacia fuera, hacia la abrazadera del remiendo fallidos intentos de grabación. Una hipótesis es que NMDG cationes más fácilmente son atrapados en rebanadas de cerebro juvenil en relación con rebanadas del cerebro adulto y pueden impedir la formación de sello; sin embargo, gigaohm juntas pueden formar fácilmente mientras que rebanadas de cerebro juvenil están completamente sumergidos en NMDG aCSF (datos no mostrados), así indicando NMDG aCSF por sí no impide el gigaohm sello formación.
La transición rápida de solución de Na+ de bajo a alto al finalizar el paso de recuperación de rebanada de cerebro inicial causa daño a las membranas neuronales y perturba el proceso de formación de sello. Esto es intuitivo ya que la transición de bajo a alto Na+, temperatura de fría a caliente y elevación dramática de la Ca2 + Mg2 + relación entre llevar colectivamente a un resurgimiento masivo de la actividad sináptica espontánea. Esta fase de rebote inhibitorio en el cerebro rebanado procedimiento es probable que después de un insulto isquémico por reperfusión del espejo. Así, a otros mitigar daño de la membrana neuronal en la fase de recuperación inicial que se ha incorporado un gradual Na+ spike en procedimiento en el que la elevación de la concentración de Na+ en la cámara de incubación NMDG protección recuperación es lenta y reproducible con la sincronización exacta. Como en el procedimiento de recuperación protectora original, la disociación temporal de Na+ elevación de la temperatura y Ca2 +/Mg2 + cociente de la elevación es beneficiosa. Pero además, el Na+ spike en procedimiento conduce a aumento incremental en la concentración extracelular de Na+ sobre los primeros momentos y grandes aumentos hacia los puntos finales del tiempo, así que el tejido cerebral una oportunidad para acomodar mejor a los crecientes niveles de Na+ . Este procedimiento es que una alternativa al intercambio de solución gradual controlado por una bomba de perfusión o gravedad líneas de goteo que conducen a incrementos constantes en los niveles de Na+ y requieren atención para entrada y salida para evitar el desbordamiento de la cámara del sector. En particular, en este Na+ procedimiento de spike la osmolalidad de la solución en la cámara de corte poco a poco se levanta durante un período de varios minutos antes de las láminas vuelven a solución osmolalidad normal, pero esto no afectó negativamente la salud del sector o abrazadera del remiendo éxito la grabación. Una solución de corte de alta osmolaridad se ha utilizado anteriormente para las preparaciones de cerebro medio rebanada para mejor preservar las neuronas de dopamina para patch clamp grabaciones57,58, demostrando así que este temporal hyperosmolality puede ser beneficioso en algunos contextos.
Mediante la aplicación de un procedimiento optimizado que combina el método de recuperación protección NMDG y gradual Na+ spike en paso la utilidad de esta metodología de rebanada del cerebro se ha ampliado para cubrir menores a través de las edades animales adultos maduras. Este protocolo actualizado ahora es conveniente para una amplia gama de edades animales mediante un único óptimo NMDG aCSF formulación y procedimiento. Si es necesario, el procedimiento de punto Na+ puede ser aplicado con un retardo progresivamente más largo o más lento curso del tiempo para mejorar la viabilidad de las rebanadas de cerebro de animales más viejos, y hemos proporcionado a una guía básica de recomendado spike en horarios según para animales de edad (ver tabla 2). Mientras que hemos proporcionado un marco básico adecuado para una amplia gama de aplicaciones, pasos avanzados adicionales pueden ser exploradas para mejorar aún más la viabilidad y longevidad de las rebanadas de cerebro de animales adultos y envejecimiento. Por ejemplo, estrategias de restauración de glutatión son particularmente eficaces en este sentido y pueden aplicarse como se describe en otra parte2,6.
Mejora de rendimiento para impugnar experimentos
El análisis de la conectividad sináptica por la grabación de abrazadera del remiendo es una aplicación exigente que requiere excelente preservación de la estructura neuronal y función para lograr una alta confiabilidad del éxito. Como el número de neuronas al mismo tiempo grabar sube linealmente, el nivel de dificultad técnica aumenta supra-linealmente. Hay numerosos modos de falla, y una de las causas más frecuentes de fracasos es la incapacidad para sellos de forma adecuada gigaohm en uno o más de las células apuntadas. Esto dramáticamente puede ralentizar el progreso, sobre todo cuando tres o más neuronas se registrarán simultáneamente. Consistente con el hallazgo de más rápido gigaohm sello tiempo de formación con el método de recuperación protección NMDG optimizado, hubo una notable mejora en la tasa de éxito y rendimiento de grabación de múltiples neuronas parche abrazadera experimentos con tanto adulto transgénicos rebanadas de cerebro de ratón y rebanadas de cerebro neuroquirúrgica humano adulto. La mejora de la eficiencia es seguramente atribuible a la formación de sello gigaohm más rápido y confiable y la mejor preservación neuronal de las rebanadas con este protocolo. Aunque este protocolo se centra en los beneficios expresamente para aplicaciones de grabación de la abrazadera del remiendo, se anticipan aumentos similares para otras aplicaciones experimentales difíciles donde la viabilidad de rebanada del cerebro es fundamental.
Este trabajo fue financiado por el Instituto Allen para la ciencia del cerebro. Los autores desean agradecer a los fundadores del Instituto Allen, Paul G. Allen y Jody Allen, por su visión, ánimo y apoyo. Agradecemos también el personal de apoyo técnico del Instituto de Allen para realizar genotipado, la cría y cuidado de los animales.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Compresstome VF-200 | Precisionary Instruments | VF-200 | Vibrating tissue slicer (recommended) |
N-methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF constituent |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | aCSF constituent |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5405 | aCSF constituent |
Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71505 | aCSF constituent |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | aCSF constituent |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | aCSF constituent |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | aCSF constituent |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | aCSF constituent |
Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | aCSF constituent |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P5280 | aCSF constituent |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | aCSF constituent |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | M1880 | aCSF constituent |
2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | Anesthetic component 1 |
2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | Anesthetic component 2 |
Curved blunt forceps | Fine Science Tools | 11065-07 | Brain dissection tools |
Fine dissecting scissors (supercut) | Fine Science Tools | 14058-09 | Brain dissection tools |
Large heavy duty scissors 7'' | Fine Science Tools | 14000-18 | Brain dissection tools |
Metal spatula | Sigma Aldrich | Z511455-1PAK | Brain dissection tools |
Razor blades | VWR | 89031-954 | Brain dissection tools |
Brain Slice Keeper-4 | Automate Scientific | S-BSK4 | brain slice holding chamber |
nylon netting | Warner Instruments | 64-0198 | For building small slice recovery chambers |
Pyrex glass beakers (250 mL) | VWR | 89090-434 | For building small slice recovery chambers |
35 mm plastic dish, round | VWR | 100488-376 | For building small slice recovery chambers |
Gas diffuser stones (10 µm) | Sigma Aldrich | 59277 | For constant carbogenation (fine bubbles) |
Agarose Type I-B | Sigma Aldrich | A0576 | For embedding brain specimens |
Micro loader tips | Eppendorf | 22491229 | For filling patch clamp electrodes |
Sylgard | VWR | 102092-312 | For making a custom dissecting platform |
Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758-100ML | For pH adjustment of media |
Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221465-25G | For pH adjustment of media |
Potassium Hydroxide | Sigma Aldrich | 221473 | For pH adjustment of media |
Plastic transfer pipets 3 mL graduated | VWR | 89497-676 | For slice transfer |
Zirconium ceramic injector blades | Cadence Specialty Blades | EF-INZ10 | http://cadenceinc.com/ |
KG-33 borosilicate glass capillary w/filament | King Glass Company | custom quote | ID: 0.87mm, OD 1.50mm |
Biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | Intern pipette solution |
Phosphocreatine disodium | Sigma Aldrich | P7936 | Intern pipette solution |
Potassium Gluconate | Sigma Aldrich | G4500-100G | Intern pipette solution |
EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Intern pipette solution |
Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | Intern pipette solution |
Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | Intern pipette solution |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | Intern pipette solution |
Heated water bath (2.5L) | VWR | 13491-060 | Miscellaneous |
Filter paper rounds | VWR | 28456-022 | Miscellaneous |
Cyanoacrylate glue | Amazon | B000BQRBO6 | Miscellaneous |
Glass petri dish | VWR | 89000-326 | Miscellaneous |
10X Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | Miscellaneous |
30 mL syringes | VWR | BD302832 | Miscellaneous |
1 mL syringes | VWR | BD-309628 | Miscellaneous |
25 5/8 gauge needles | VWR | 89219-292 | Miscellaneous |
Thermomixer (w/1.5 mL tube block) | VWR | 89232-908 | To keep agarose molten |
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ISSN 1940-087X
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