A monte intero

Montare tutto ibridazione in situ (WMISH) è una tecnica che consente la risoluzione spaziale di molecole di acido nucleico (spesso mRNA) all'interno di una preparazione dei tessuti 'intero monte', o stadio di sviluppo (ad esempio, un embrione o larva) di interesse. WMISH è estremamente potente, perché può contribuire in modo significativo alla caratterizzazione funzionale di genomi complessi metazoi, una sfida che sta diventando sempre più di un collo di bottiglia con il diluvio di dati di sequenza di prossima generazione. Nonostante la semplicità concettuale della tecnica molto tempo è spesso necessaria per ottimizzare i vari parametri inerenti esperimenti WMISH per sistemi modello nuovi; sottili differenze nelle proprietà cellulari e biochimiche tra tipi di tessuto e le fasi di sviluppo significa che un singolo metodo WMISH potrebbe non essere adatto per tutte le situazioni. Abbiamo sviluppato una serie di metodi WMISH per il modello gasteropode Lymnaea stagnalis riemergenti che generano coerente esegnali WMISH chiari per una serie di geni, e in tutte le fasi di sviluppo. Questi metodi includono l'assegnazione di larve di sconosciuto età cronologica a una finestra ontogenetica, la rimozione efficiente di embrioni e larve dalle loro capsule uovo, l'applicazione di un idoneo trattamento con proteinasi-K per ogni finestra ontogenetica e ibridazione, post-ibridazione e immunolocalizzazione gradini. Questi metodi forniscono una base da cui il segnale risultante per un dato trascrizione di RNA può essere ulteriormente raffinato con aggiustamenti specifici sonda (principalmente sondare concentrazione e temperatura di ibridazione).