Metoder för att studera Mrp4 innehållande Makromolekylär i regleringen av Fibroblast Migration

Multiresistens protein 4 (MRP4) är en medlem av den ATP-bindande kassett familj av membrantransportörer och är en endogen effluxtransportören av cykliska nukleotider. Genom att modulera intracellulär cyklisk nukleotid koncentration, kan MRP4 reglera flera cykliska nukleotid-beroende cellulära händelser, inklusive cellmigration. Tidigare visade vi att i avsaknad av MRP4, fibroblastceller innehåller högre halter av intracellulära cykliska nukleotider och kan migrera snabbare. För att förstå de bakomliggande mekanismerna för detta konstaterande, antog vi en direkt ändå mångfacetterad strategi. Först isolerade vi potentiella samverkande proteinkomplex av MRP4 från en MRP4 överuttryck cellsystem med hjälp av immunoprecipitation följt av masspektrometri. Efter att ha identifierat unika proteiner i MRP4 interactome, utnyttjade vi Påhittighet Pathway Analysis (IPA) för att utforska rollen av dessa protein-proteininteraktioner i samband med signaltransduktion. Vi klar potial roll MRP4 proteinkomplexet i cellmigrering och identifierade F-aktin som en viktig mediator av effekten av MRP4 på cellmigration. Denna studie underströk också betydelsen av cAMP och cGMP som nyckelspelare i migrationsfenomenet. Med hjälp av hög halt mikroskopi, utförde vi cellmigrationsanalyser och observerade att effekten av MRP4 på fibroblast migration är helt avskaffas genom avbrott i aktincytoskelettet eller inhibering av cAMP-beroende kinas A (PKA). Att visualisera signalering modulationer i en vandrande cell i realtid, utnyttjade vi en FRET-baserad sensor för mätning av PKA-aktivitet och fann, närvaron av mer polariserad PKA aktivitet i närheten av den främre kanten av migrerande Mrp4 ^{- / -} fibroblaster, jämfört med Mrp4 ^{+ / +} fibroblaster. Detta i sin tur ökad kortikal aktin bildning och förstärkt processen för migration. Vår strategi möjliggör identifiering av proteinerna som agerar nedströms till MRP4 och ger oss en överutsikt över deltar i MRP4 beroende reglering av fibroblast migration mekanism.