In vitro Colony Analyser til karakterisering Tri-potente progenitorceller isoleret fra voksne murine Pancreas

Stem og stamceller fra voksne bugspytkirtlen kunne være en potentiel kilde til terapeutiske beta-lignende celler til behandling af patienter med type 1-diabetes. Det er dog stadig uvist, om der findes stamceller og progenitorceller i den voksne pancreas. Forskning strategier via cre-lox afstamning-sporing i voksne mus har givet resultater, som enten støtte eller afkræfte den idé, at betaceller kan genereres fra kanalerne, den formodede sted, hvor voksne bugspytkirtlen stamfædre kan opholde. Disse in vivo cre-lox slægt-tracing metoder kan imidlertid ikke besvare spørgsmål fra selvfornyelse og multi-slægt differentiering-to kriterier, der er nødvendige for at definere en stamcelle. Til at begynde at behandle dette tekniske hul, vi udtænkt 3-dimensionelle koloni assays for bugspytkirtlen forfædre. Kort efter vores indledende offentliggørelse, andre laboratorier uafhængigt udviklet en lignende, men ikke identiske, metode kaldet organoide assay. Sammenlignet med den organoide assay vores fremgangsmåde anvendermethylcellulose, der danner viskose opløsninger, som tillader optagelse af ekstracellulære matrixproteiner ved lave koncentrationer. De methylcellulose-holdige analyser tillader lettere påvisning og analyser af stamceller på enkelt-celle niveau, som er afgørende, når stamfædre udgør en lille sub-population, som det er tilfældet for mange voksne orgel stamceller. Sammen resultater fra flere laboratorier demonstrerer in vitro selvfornyelse og multi-slægt differentiering af pancreasstamfaderceller-lignende celler fra mus. De nuværende protokoller beskriver to methylcellulose-baserede koloniassays at karakterisere muse pancreas progenitorer; Den ene indeholder et kommercielt præparat af murine ekstracellulære matrixproteiner, og den anden en kunstig ekstracellulært matrixprotein kendt som en laminin hydrogel. De her viste teknikker er 1) dissociation af bugspytkirtlen og sortering af CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ duktale celler fra voksne mus, 2) enkelt celle manipulation af sorted celler, 3) enkelt koloni analyser bruger mikrofluid QRT-PCR og hel-mount immunfarvning, og 4) dissociation af primære kolonier i encellede suspensioner og re-plating til sekundære koloni analyser til at vurdere selvfornyelse eller differentiering.