Mikroinjektion for Transgenese og Genome Redigering i Trepigget Sticklebacks

Den trepigget hundestejle fisk har vist sig som et kraftfuldt system til at studere den genetiske basis for en bred vifte af morfologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige fænotyper. De bemærkelsesværdigt forskellige fænotyper der har udviklet sig som marine populationer tilpasse sig utallige ferskvandsmiljøer, kombineret med evnen til at krydse havvand og ferskvand former, giver en sjælden hvirveldyr system, hvor genetik kan anvendes til at kortlægge genomiske regioner at styre udviklet træk. Fremragende genomiske ressourcer er nu tilgængelige, lette molekylær genetisk dissektion af udviklede ændringer. Mens mapping eksperimenter generere lister over interessante kandidatgener, er funktionelle genetiske manipulationer kræves for at afprøve roller disse gener. Genregulering kan studeres med transgene reporterplasmider og BAC'er integreret i genomet ved hjælp af Tol2 transposasen systemet. Funktioner af specifikke kandidatgener og cis reguleringsmyndigheder elementer kan vurderes ved at inducere målrettetmutationer med talen og CRISPR / Cas9 genom redigering reagenser. Alle metoder kræver indføring af nukleinsyrer i befrugtede én-celle hundestejle embryoer, en opgave gjort udfordrende ved den tykke chorion af hundestejle embryoer og den relativt lille og tynd blastomer. Her er en detaljeret protokol til mikroinjektion af nukleinsyrer i hundestejle embryoner beskrevet for transgene og genom redigeringsfunktioner at studere genekspression og funktion, samt teknikker til at vurdere succes transgenese og inddrive stabile linjer.