Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

De driedoornige stekelbaars vis zich ontwikkeld tot een krachtig systeem om de genetische basis van uiteenlopende morfologische, fysiologische bestuderen en gedragsmatige fenotypes. De opmerkelijk verschillende fenotypen die zijn geëvolueerd mariene populaties passen aan talloze zoetwatermilieus, gecombineerd met de mogelijkheid mariene en zoetwater vormen kruisen, vormen een zeldzame vertebraat systeem waarin genetica kan worden gebruikt om genomische regio kaart besturen geëvolueerd eigenschappen. Uitstekende genomische middelen zijn nu beschikbaar, het vergemakkelijken van moleculair genetische dissectie van geëvolueerd veranderingen. Terwijl mapping experimenten genereren van lijsten van interessante kandidaatgenen zijn functionele genetische manipulaties nodig om de rol van deze genen te testen. Genregulatie kan worden bestudeerd met transgene reporter plasmiden en BACs geïntegreerd in het genoom via het transposase Tol2 systeem. Functies van specifieke kandidaat-genen en cis-elementen van regelgevende kan worden beoordeeld door het induceren gerichtmutaties met TALEN en CRISPR / Cas9 genoom bewerken reagentia. Alle methoden vereisen introduceren van nucleïnezuren in bevruchte één-cel stekelbaars embryo's, een taak moeilijker geworden door de dikke chorion van stekelbaars embryo's en de relatief klein en dun blastomere. Hier is een gedetailleerd protocol voor micro-injectie van nucleïnezuren in stickleback embryo beschreven transgene genoom en bewerkingssoftware om genexpressie en functie te bestuderen, alsook technieken voor het succes van transgenese beoordelen en herstellen stabiele lijnen.