עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH R01 # DE021475 (CTM), גידול NIH Predoctoral הדרכה גרנט 5T32GM007127 (PAE), וכן מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (NAE). אנו מודים קווין Schwalbach לביצוע BAC recombineering וזריקות, ניק Donde להפקת הנתונים רצף CRISPR סנגר, וקתרין ליפארי עבור משוב מועיל על פרוטוקול ההזרקה.

כל העבודה דגים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קליפורניה-ברקלי (מספר פרוטוקול R330). 1. הכינו חומצות גרעין עבור הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tol2 פלסמיד Transgenesis (מעובד מתוך פישר 26). <ol styl...

חד-תאי הזרקה עוברת קוצן עבור transgenesis או עריכת הגנום מציג שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, ביחס עוברי דג זברה, הסיסי עוברי קוצן קשה ולעתים קרובות ישבור מחטים. בעיה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש micropipettes זכוכית עבה וחזק וההזרקה בניצב הסיסי (ראה פרוטוקול, איור 2). הה...

מרכיב בסיסי אחד של הבנה כיצד מגוון ביולוגי המתבקשת הוא לקביעת הבסיסי הגנטי והתפתחותיים של שינויים פנוטיפי התפתחו בטבע. דג עוקצן threespine, Gasterosteus aculeatus, התפתח מודל מצוין לחקר הבסיס הגנטי של אבולוציה. הקוצנים עברו שינויים אבולוציוניים אדפטיבית רבים כמו דגים ימיים יישבו בסביבות מים מתוקים אינספור ברחבי חצי הכדור הצפוני, וכתוצאה מכך מורפולוגיים דרמטי, פיזיולוגיים, ושינויים התנהגותיים 1. בגנום של אנשים מגובה של עשרים ואחד אוכלוסיות קוצן היה רצף והרכיבו, ומפה הצמדה צפיפות גבוהה נוצרה על מנת לשפר יותר את מכלול 2,3. ניסויי מיפוי גנטיים זיהו אזורים גנומית שבבסיס פנוטיפים התפתחו 4 - 6, ובעוד כמה מקרים, התפקידים התפקודיים של גני מועמדים ספציפיים נבדקו 7,8. מספר האזורים גנומית שבבסיס שינויים מורפולוגיים זוהה עם גני מועמדים מבטיחים, אך מועמדים אלו טרם נבדקו מבחינה תפקודית 9 - 12. בנוסף, הקוצנים הם מודלים נפוצים ללימודים של גנטיקה של אוכלוסיות / הגנומיקה 13,14, התפצלות 15, התנהגות 1, אנדוקרינולוגיה 16, ecotoxicology 17, אימונולוגיה 18 ופרזיטולוגיה 19. מחקרים עתידיים בכל אחד מהתחומים הללו ייהנו היכולת לבצע מניפולציות גנטיות תפקודיות הקוצנים. בנוסף מניפולצית רצפי הקידוד שלהם, את התפקידים של גני מועמדים ניתן להעריך על ידי לימוד הרצפים רגולטורית ציס שלהם ועל ידי הגדלה מבחינה תפקודית, קטן, או ביטול הביטוי של גן המועמד. שיטות Microinjection ו transgenesis ב הקוצנים מבוססות היטב 7,8,20 ו בתחילה פותחו באמצעות meganuclease בתיווךשיטה 21 תוארה לראשונה בשנת medaka 22. שיטת microinjection השונה המוצגת כאן כבר אופטימיזציה עבור שניהם transgenesis Tol2 בתיווך ופתחה לאחרונה ריאגנטים עריכת הגנום כולל TALENs ו CRISPRs. שינויי האלמנטים רגולטורית ציס נחשבים קריטי לאבולוציה מורפולוגיים, כמו השינויים רגולטורית ציס יכולים למנוע את ההשלכות השליליות של pleiotropic קידוד מוטציות 23. לכן, בדיקה והשוואת רצפים רגולטורית ציס משוערים הפכה ליעד מרכזי של מספר גדל והולך של מחקרים אבולוציוניים. בנוסף, רוב גרסאות מחלות אנושיות הן גרסאות רגולטוריות 24,25, ומערכות חוליות מודל נדרשים עז ללמוד לתפקד אלמנט רגולטורית ציס וההיגיון. דגים כי לדשן העוברי שלהם כלפי חוץ במספרים גדולים להציע מערכות חוליות רבות עצמה כדי לחקור -regulation cis. מערכת transposon Tol2, שבו foreiDNA GN להיות משולבת בגנום מוקף Tol2 transposase אתרי קישור ושיתוף הזריקו Tol2 transposase mRNA, עובד עם יעילות גבוהה לשילוב בהצלחה פלסמיד בונה לתוך הגנום דגים 26 - 28. בדרך כלל, משפר הפוטנציאל הוא משובטים במעלה הזרם של האמרגן הבזליים (כגון hsp70l 29) ואת הגן כתב ניאון כגון EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת) או mCherry בתוך עמוד השדרה Tol2 והזריקו עם transposase mRNA 26. תצפית ביטוי של כתב הניאון, בין אם עובר מוזרקים או צאצא עם transgenes משולב ביציבות, מספקת מידע על ויסות spatiotemporal של ביטוי גנים מונעת על ידי המשפר המשוער. בניסויים נוספים, משפרי תוקף ניתן להשתמש בכונן ביטוי יתר ספציפי רקמות של גנים של עניין. באשר לניתוח אזורי רגולטורית ציס גדולים, באיכות גבוהה genom בקנה הכנסic ספריות באמצעות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACS) נבנו עבור שני הקוצנים ימיים מים מתוקים 30. Bács אלה ניתן recombineered להחליף גן עם גן כתב ניאון בהקשר של (kb 150-200) גדול באזור הגנומי 31. כתב הניאון מתבטא אז דפוס spatiotemporal כפי שנקבע על ידי רצפי רגולציה בתוך BAC. עבור מחקרים בדגים, אתרי Tol2 ניתן להוסיף גם את BAC כדי להקל אינטגרציה הגנומי 32,33. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות כאשר הכלאה באתרו הוא מאתגר מבחינה טכנית, את ההודעה הניאון של BAC יכול לשמש כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים, כפי שהוכח לחלבון קוצן עצם המוךפו&quot;גנטי שהולך 6 (Bmp6) 20. בנוסף, דפוסי ביטוי ניאון אדם יכול להיות במעקב לאורך זמן, אשר לא יכול להיות מושלם עם הכלאה באתרה. Bács יכול לשמש גם כדי להוסיף additionaעותק l של אזור גנומי כדי להגדיל את המינון של גן של עניין. לצורך המחקר של תפקוד הגן, עריכת הגנום הוא השדה המתרחב בפיצוץ, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שינויים ממוקדים אל רצפי הגנום במגוון רחב של אורגניזמים 34. מפעיל דמוי תמלול nucleases מפעיל (TALENs) הם nucleases מודולרי, ספציפית רצף מבודד במקור פתוגנים צמח יכול להיות מהונדסים בדיוק להיקשר ישירות רצף גנומי של בחירה וליצור גדיל כפול לשבור 35,36. באשכולות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / מערכות CAS נמצאו במקור חיידקים להשתמש RNA מדריך ואת החלבון Cas9 כדי ליצור הפסקה ברצף ה- DNA היעד משלים מדריך 37. התיקון בדיעבד של הפסקת הגדיל הכפולה שיצרה שתי TALENs ו CRISPRs לעתים קרובות משאיר אחריו כניסה קטנה או מחיקה, אשר יכול לשבש את הפונקציה של רצף היעד35-37. בשנת הקוצנים, שימשו TALENs לשבש ביטוי גנים על ידי מיקוד משפר 20, ושניהם TALENs ו CRISPRs יצרו בהצלחה מוטציות קידוד רצפים (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול מפורט עבור הדור של CRISPRs לשימוש דג הזברה יכול לשמש כקו מנחה לפתח CRISPRs עבור הקוצנים 38. מהונדס וניסויי עריכת הגנום דורשים מבוא של חומצות גרעין לתוך עובר חד-תאי שהופרה זה עתה. על ידי הצגת כלי transgene או הגנום עריכת בשלב מוקדם של התפתחות, מספר תאי הבת מניפולציות גנטיות בעובר מוגדל. עובר מוזרק אז מוקרנים חזותיים עבור קרינה או הוקרנתי מולקולרי עבור שינויים בגנום. אם תאי תורם germline ממוקדים בהצלחה, את הגן או המוטציה יכול להיות עברה על קבוצת משנה של צאצאים, גם כאשר הקטלניות לאחר הזרקה היא גבוהות. דג הפסיפס ניתן outcrossed אוintercrossed וצאצאיהם הוקרנו לשחזר את אללים מוטנטים או transgene משולב ביציבות של ריבית. פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנסת transgenes ריאגנטים עריכת הגנום לעוברי קוצן חד-תאים וניטור עבור שינויים גנומיים מוצלחים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope with transillumination</td>
			<td style="width:145px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">S6e/ KL300 LED</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manual micromanipulator</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MM33</td>
			<td style="width:167px;">Marzhauser M33 Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Injecion system</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPPI-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Back pressure unit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">BPU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette holder kit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPIP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic base holder</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">Magnetic base</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Foot switch</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FSW</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron plate (magnetic base)</td>
			<td style="width:145px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:145px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5% phenol red in DPBS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td style="width:167px;">injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">#5 forceps, biologie dumoxel&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td style="width:167px;">for needle breaking</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">E210</td>
			<td>holds needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6&#34;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td>
			<td style="width:145px;">Lenox</td>
			<td>20571 (S636RP)</td>
			<td>hold eggs for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">13 cm x 13 cm glass plate</td>
			<td style="width:145px;">any hardware store</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&#160;</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-F4</td>
			<td style="width:167px;">*harder glass than zebrafish injection capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">150 x 15mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td>raise stickleback embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td>store eggs pre-injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean Salt</td>
			<td style="width:145px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine methanesulfonate/MS-222</td>
			<td style="width:145px;">Western Chemical Inc</td>
			<td style="width:119px;">MS222</td>
			<td style="width:167px;">fish anaesthesia/euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sp6 transcription kit</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;">For transcription of TALENs and transposase mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:167px;">purify transposase or TALEN RNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QiaQuick PCR cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;">clean up plasmids for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K 20 mg/ml</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM2546</td>
			<td style="width:167px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nucleobond BAC 100 kit</td>
			<td style="width:145px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740579</td>
			<td>for BAC DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12943</td>
			<td style="width:167px;">contains endotoxin rinse buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAQuick Gel Extraction</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704&#160;</td>
			<td>for sequencing induced mutations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P2069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50X Tris-acetate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5-10KbRNA ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop&#160; Spectrophotometer</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X PBS</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NP-40</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris pH 8.3</td>
			<td style="width:145px;">Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-strip PCR tube</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

דג עוקצן threespine התפתח כמערכת רבה עצמה כדי לחקור את הבסיס הגנטי של מגוון רחב של מורפולוגיים, פיסיולוגי, פנוטיפים התנהגותיים. פנוטיפים המגוונים להפליא שהתפתחו כמו אוכלוסיות ימיות להסתגל לסביבת מים מתוקה אינספור, בשילוב עם היכולת לחצות צורות ימיות מים מתוקים, לספק מערכת החולייתנים נדירה בם גנטיקה יכולה לשמש כדי למפות אזורי גנומית שליטה התפתחה תכונות. משאבי גנומי מצוינים זמינים כעת, הקלה לנתיחת גנטיקה מולקולרית של שינויים התפתחו. בעוד ניסויי מיפוי ביצירת רשימות של גני מועמדים מעניינים, מניפולציות גנטיות פונקציונליות נדרשות לבחון את התפקידים של גנים אלה. ויסות גנים ניתן ללמוד עם פלסמידים BACS כתב מהונדסים משולבים לתוך הגנום באמצעות מערכת transposase Tol2. פונקציות של גנים מועמדים ספציפיים ואלמנטים רגולטורית ציס ניתן להעריך על ידי גרימת ממוקדמוטציות עם Talen ו CRISPR / Cas9 ריאגנטים עריכת הגנום. כל השיטות דורשות החדרת חומצות גרעין לעוברי קוצן חד תא מופרה, משימה שנעשתה מאתגר ידי סיסי העבה של עוברת קוצן ואת blastomere הקטנה ורזה יחסית. כאן, פרוטוקול מפורט עבור microinjection של חומצות גרעין לעוברי קוצן מתואר ליישומים מהונדסים הגנום עריכה ללמוד ביטוי גנים ותפקוד, כמו גם טכניקות כדי להעריך את ההצלחה של transgenesis ולשחזר קווי יציבה.

עבור transgenes גן הכתב כי יש פעילות משפרת, זריקה מוצלחת תגרום ביטוי ספציפי, סלולארי של transgene (איור 4 א, ​​4C). דגים מוזרקים לאחר מכן ניתן outcrossed לייצר קווי יציבה (דוגמא קו BAC יציב שמוצג באיור 4B). הזרקת DNA לעוברי קוצן בדרך כלל תוצאות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks at JoVE.com

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

The overall goal of this microinjection technique is to generate transgenic and genome edited stickleback fish to test gene and enhancer function. This method can help answer key questions in developmental and evolutionary genetics such as how genes and enhancers function to generate body pattern. The main advantage of this technique is that it efficiently generates transgenic fish for functional genetic analysis.After preparing toll two plasmids and mRNA according to the text protocol, pull at least four micropipette needles from borosilicate glass. Store vertically in a capillary storage jar which the sharp ends facing down. To fertilize up to one hundred stickleback eggs, add 50 microliters of sperm solution and use a pipette tip to gently stir to ensure all eggs are fertilized.While working on ice, back fill at least three needles by pipetting 0.5 microliters of injection solution into the blunt end of the needle and allow it to drain. In the meantime, turn on the transillumination light for the dissecting microscope and place a 13 square centimeter glass plate on the microscope light base with a 15 centimeter plaster saw blade on top of the glass plate. Orient the saw perpendicular to the injection apparatus with the indentations facing towards the needle holder then turn on the control box and ensure the pressure is set to approximately 175 kilopascals.Set the injection duration to 180 milliseconds. Next loosen the needle holder, then insert a filled needle into the holder until resistance of the rubber holder can be felt and tighten the needle holder until it is finger tight. Then adjust the needle angle to approximately 45 degrees.Use the micromanipulator controls to adjust the needle so that the end is centered in the field of view. Zoom in to approximately 40x magnification and focus on the tip of the needle, which should not be touching the glass below. With watchmaker's forceps grasp the tip of the needle two to three forceps'width from the end and gently break the tip at a 60 degree angle.Then press the injection foot pedal several times to test whether the needle is broken. After a few taps, tiny red droplets should begin to come out of the end. Use a disposable transfer pipette to place a few drops of stickleback water on the glass plate.Gently lower the needle into the water, then increase the back pressure until a faint stream of pink liquid emerges from the needle. Retract the needle as far as possible so that it will not be damaged while preparing the embryos. Approximately 25 minutes after fertilization, use two 10 microliter pipette tips to remove five to 10 embryos from the clutch and transfer to the glass plate.With the pipette tips, gently separate the embryos into individual indentations of the saw blade using caution not the puncture the embryos. Next with a transfer pipette add enough stickleback water to cover the embryos. Then after three to five seconds, remove most of the water leaving only a small volume covering each embryo.Starting with the embryo farthest away, slide the glass plate and zoom in on the embryo so that it fills approximately 25 percent of the field of vision. Lower the needle into the field of vision, then use a 10 microliter pipette tip to gently rotate the embryo to identify the blastomere, a grainy, slightly yellow, raised bump of cytoplasm on the top of the yolk. Rotate the embryo so that the blastomere is directly perpendicular to the end of the needle.Lower the needle applying pressure slowly and evenly to pierce the corion and insert the needle into the cytoplasm without pushing it through the underlying yolk. Depress the foot pedal three to four times to inject so that a red bolus with slightly diffused edges fills approximately 1/8 the diameter of the cytoplasm. Having a sharp needle perpendicular to the corion will facilitate this step.Limiting the amount of water added will help to keep the corion soft. And finally, targeting the cytoplasm will increase the likelihood of obtaining a transgenic animal. Use the micromanipulator controls to retract the needle, and with the 10 microliter pipette tip, hold down the embryo if it sticks to the needle.After retracting the needle, slide the glass plate to align the next embryo with the needle and repeat the injection. When all embryos have been injected, use the transfer pipette with the end cut off to add water to the plate. Then use a transfer pipette to collect the embryos and place them in a 150 millimeter petri dish filled with stickleback water.Incubate the embryos at 18 degrees Celsius. One day after injection gently pour off the stickleback water and replace with fresh water. Check for dead or malformed embryos and remove to prevent contamination.As illustrated here, for transgenes that have enhancer activity, successful injection results in specific cellular expression of the transgene. For example, in the pectoral and median fins and the notochord. Injected fish can then be outcrossed to produce stable lines such as this back stable line that drives GFP expression in the embryonic heart at four days post fertilization.For an active enhancer, 40 to 50 percent of embryos will show tissue specific transgene expression, for example, in the median and pectoral fins. Up to 100 percent of GFP positive F0 fish expressing toll two plasmid transgenes produce transgenic offspring. However, the percent of offspring carrying the transgene varies widely from less than one percent to 72 percent.Saving only GFP positive injected embryos generally increases transmission efficiency. Only up to 10 percent of F0 back injected stickleback embryos show fluorescence in expected tissues. In addition, the transmission rate of backs is lower than that of plasmid constructs.With only up to 14 percent of screened sticklebacks transmitting the back. In contrast to the low efficiency of back transgenesis, 70 to 100 percent of fish injected with talons have mosaic lesions. Here an uncut PCR amplicon in each of the injected embryos indicates that some cells in each embryo carry lesions at the target locus.Once mastered, this technique can be done in a little over an hour for a clutch of 100 embryos if performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember that practice and patience are required to improve technique and embryo survival. Following this procedure, other methods such as confocal microscopy can be used to answer further questions about detailed patterns of enhancer expression.Also, genome edited fish can be grown in cross to study phenotypes resulting from induced mutations. After it's development, this technique paved the way for researchers in the field of evolutionary and developmental genetics to study gene regulation and function in sticklebacks. After watching this video, you should have a good understanding of how to inject stickleback embryos for transgenesis and genome editing.