Isolering av murina embryonala Hemogenic endotelceller

Specifikationen av hemogenic endotelceller från embryonala kärlendotel sker under korta utvecklingsperioder inom olika vävnader, och är nödvändig för uppkomsten av slutgiltiga HSPC från mus extra embryonala gulesäcken, placenta, navel fartyg och embryonala aorta-gonad-mesonephros ( AGM) regionen. Den övergående natur och små storleken på denna cellpopulation gör sin reproducerbar isolering för noggrann kvantifiering och experimentella applikationer tekniskt svårt. Vi har etablerat en fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) -baserad protokoll för samtidig isolering av hemogenic endotelceller och HSPC under sin topp generationstider i gulesäcken och årsstämma. Vi visar metoder för dissektion av gulesäcken och AGM vävnader från musembryon, och vi presenterar optimerade vävnad matsmältningen och antikroppkonjugering förutsättningar för maximal cellöverlevnad före identifiering och hämtning via FACS. Representativa FACS analys tomter visat att identifiera hemogenic endotelceller och HSPC fenotyper, och beskriva en metylcellulosa-baserad analys för att utvärdera deras blodbildande potential på en klonal nivå.