This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على النمو أو التلاعب الكوكسيلا البورنيتية RSA439 NMII في مستوى الاحتواء الجسدي 2 مختبر وداخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية في الامتثال للمبادئ التوجيهية المحلية. ويرد رسم تخطيطي للالعكسي ترنسفكأيشن والفحص النبات...

نظم إفراز، والبروتينات المستجيب البكتيرية هذه أنظمة النقل في سيتوبلازم الخلايا المضيفة، هي عنصر الفوعة المهم أن تستخدم العديد من أنواع البكتيريا المسببة للأمراض إنشاء العدوى داخل محاريب تنسخي فريدة من نوعها. وكانت محورا للعديد من المجموعات البحثية لتحقيق التفاعل ...

الكوكسيلا البورنيتية هو الممرض داخل الخلايا الفريدة التي تسبب الحيوانية المصدر العدوى البشرية بالحمى. ويرتبط هذا المرض مع طائفة واسعة من العروض السريرية تمتد من الانقلاب المصلي بدون أعراض للعدوى تهدد الحياة المزمن الذي غالبا ما يظهر عن سنوات التهاب الشغاف بعد التعرض 1. تحدث العدوى البشرية في المقام الأول من خلال استنشاق هباء ملوثة المجترات الخزان الرئيسي للعدوى، ولا سيما، الأبقار والأغنام والماعز. على الرغم من أن العدوى الكوكسيلا في هذه الحيوانات عادة تحت الإكلينيكي، والعدوى قد تسبب الإجهاض والحمل البكتيري كبير داخل السائل الولادة والمشيمة يمكن أن تلوث البيئة المحلية 1. مثال على مثل هذا التلوث عبء هائل يمكن أن يكون على وحظ الصحة العامة والزراعة والصناعة مؤخرا في اندلاع حمى Q التي وقعت في هولندا 2. بين عامي 2007 وعام 2010، تم تشخيص أكثر من 4000 حالة إصابة بشرية بالحمى وترتبط هذه الفاشية إلى تلوث كبير من مزارع الماعز 3. بالإضافة إلى ذلك، الكوكسيلا هو سلاح بيولوجي محتمل، حسب تصنيف المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها، ويرجع ذلك إلى الاستقرار البيئي للبكتيريا والجرعة المعدية منخفضة اللازمة ليسبب الاعتلال والوفيات 4 الشديد. يوجد الكوكسيلا على مرحلتين: أنا الكائنات المرحلة، المعزولة من المصادر الطبيعية، وضراوة للغاية والمرحلة الثانية الكائنات الحية والموهن للغاية في الجسم الحي. على سبيل المثال، وبعد عدة في ممرات المختبر من الكائنات الكوكسيلا البورنيتية تسعة مايل المرحلة الأولى، تم إنتاج المرحلة الثانية البكتيريا التي تحتوي على حذف الكروموسومات لا رجعة فيه مما أدى إلى lipopolysaccharide في اقتطاع (LPS) 5. هذه السلالة، C. البورنيتية NMII، يشبه ظاهريا إلى المرحلة الأولى في نماذج زراعة الأنسجة ويوفر طريقة أكثر أمانال للباحثين لدراسة المرضية الكوكسيلا في مختبرات 5. في السنوات الأخيرة عدة اختراقات تقدمت بسرعة مجال علم الوراثة الكوكسيلا. وأبرزها، وتطوير وسائل الإعلام ممحوضة (يحمض المتوسطة السيستين سترات - ACCM-2) سمحت النمو خالية من الخلايا من الكوكسيلا في كل من السائل وعلى وسائل الاعلام الصلبة 6،7. وأدى ذلك إلى تحسينات مباشرة من الأدوات الجينية المتاحة للالكوكسيلا بما في ذلك نظام التعبير الجيني محرض، ناقلات المكوك وأنظمة ينقول عشوائية 8-11. وفي الآونة الأخيرة، كما تم تطوير طريقتين لتثبيط الجين المستهدف، مما يمهد الطريق لفحص المرشحين الجينات الفوعة محددة 12. وبعد استيعاب من قبل البلاعم السنخية، الكوكسيلا يعيد إلى أرقام عالية داخل حجرة بغشاء يسمى Coxiella- تحتوي على فجوة (لجنة تنسيق المفردات). لجنة تنسيق المفردات يتطلب الاتجار التقامي المضيف عشرالخام الإندوسومات المبكرة والمتأخرة حتى ينضج إلى المستمدة يحلول عضية 13. وطوال هذه العملية، لجنة تنسيق المفردات تستحوذ على العوامل المضيفة إما أن تظهر بشكل عابر أو تظل مرتبطة فجوة، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، Rab5، Rab7، CD63 وLAMP-13-15 يناير. تكرار الكوكسيلا داخل الخلايا المضيفة يعتمد كليا على نقطة / آي سي إم نوع IVB نظام إفراز تعمل بكامل طاقتها (T4SS) 8،16،17. هذا النظام إفراز هو بنية متعددة البروتينية ذات العلاقة أجدادهم لأنظمة التصريف وتمتد كل من الأغشية البكتيرية وفجوي لتقديم البروتينات البكتيرية، ووصف المؤثرات، في السيتوبلازم المضيف (18). والكوكسيلا T4SS وظيفيا تشبه الى حد بعيد نوع IVB نقطة / نظام إفراز آي سي إم تتميز كذلك من البكتيريا المستروحة 19،20. ومن المثير للاهتمام، لا تحدث تفعيل T4SS ولاحق المستجيب النبات حتى يصل الكوكسيلا والحمضية-يحلول المشتقةعضية، ما يقرب من 8 ساعات بعد العدوى 17،21. حتى الآن، وقد تم تحديد أكثر من 130 المؤثرات نقطة / آي سي إم 9،17،22-24. العديد من هذه المؤثرات على الأرجح تلعب أدوارا هامة خلال تكرار الكوكسيلا داخل الخلايا المضيفة؛ ومع ذلك، سوى عدد قليل من المؤثرات تم التعرف على وظيفيا 25-29. في هذه الدراسة يمكننا الاستفادة من مضان أساس النبات فحص يعتمد على الانقسام الركيزة CCF2-AM الحنق (المشار إليه فيما بعد الركيزة BlaM) عن طريق النشاط β-اكتاماز داخل سيتوبلازم الخلية المضيفة (الشكل 1). وتنصهر في الجينات التي تهم تيم-1 β-اكتاماز (BlaM) على البلازميد المراسل أن يوفر التعبير التأسيسي. وتتألف الركيزة BlaM اثنين fluorophores (الكومارين وفلوريسئين) التي تشكل زوج الحنق. الإثارة من نتائج الكومارين في الحنق من فلوريسئين والانبعاثات مضان أخضر في غياب النبات المستجيب. ومع ذلك، إذا كان بلوخينتقل إلى M-المستجيب البروتين الانصهار في السيتوبلازم المضيف، الناتجة β-اكتاماز يشق نشاط عصابة β لاكتام الركيزة BlaM، يفصل الزوج الحنق إنتاج الانبعاثات مضان الأزرق بعد الإثارة. وقد تم هذا الاختبار النبات ثبت كذلك نهج لتحديد البروتينات المستجيب من مجموعة واسعة من مختلف البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية، بما في ذلك جيم البورنيتية، L. المستروحة، L. اللونغبيشية، الكلاميديا، ممرض للأمعاء E. القولونية والسالمونيلا والبروسيلا 17،30-35. لتحديد دور العوامل المضيفة محددة بشأن الكوكسيلا المستجيب النبات نحن نستخدم طريقة راسخة لإسكات الجينات المعروفة تدخل الحمض النووي الريبي، وخاصة الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا). حددت أصلا في ايليجانس انواع معينة، تدخل الحمض النووي الريبي هو عملية الخلوية الذاتية الحفظ المستخدمة لdefe الفطريةNSE ضد الفيروسات وكذلك الجين تنظيم 36،37. بعد ربط تسلسل معين سيرنا، وتدهور مرنا يحدث من خلال RISC (الناجم عن الحمض النووي الريبي مجمع إسكات) مما أدى إلى إسكات الجينات المحددة أو ضربة قاضية 38. في هذه الدراسة، تم استخدام سيرنا لاستهداف اثنين من البروتينات المضيفة، Rab5A وRab7A، وهي منظمات هامة لمسار التقامي. تم التأكد من تأثير إسكات Rab5A وRab7A على النبات المستجيب باستخدام C. البورنيتية pBlaM-CBU0077. وقد تم اختيار CBU0077 كما تبين أنه سبق أن translocated من قبل النظام إفراز نقطة / آي سي إم من الكوكسيلا 17. الاستفادة من كل سيرنا إسكات الجينات وفحص النبات fluorescencebased الموصوفة هنا، بدأنا في إنشاء دور للعوامل المضيف في النبات البروتينات المستجيب من الكوكسيلا. ويمكن تطبيق هذا النهج إلى مجموعة واسعة من كل من البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية التي تمتلك secretio مماثلأنظمة ن المسؤولة عن النبات من البروتينات المستجيب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

الكوكسيلا البورنيتية، العامل المسبب للحمى Q، هو الممرض داخل الخلايا التي تعتمد على الرابع نقطة / آي سي إم نظام إفراز نوع لتأسيس مكانة تنسخي. وtranslocated فوج من المؤثرات من خلال هذا النظام إلى داخل الخلية المضيفة للتلاعب عمليات المضيفة والسماح بإنشاء فجوة المستمدة يحلول فريدة للنسخ المتماثل. الطريقة المعروضة هنا يشمل الجمع بين اثنين من التقنيات راسخة: إسكات الجينات المحددة باستخدام سيرنا وقياس النبات المستجيب باستخدام الركيزة القائم على الحنق التي تعتمد على النشاط β-اكتاماز. تطبيق هذين النهجين، يمكننا أن نبدأ في فهم دور العوامل المضيفة في البكتيرية وظيفة نظام إفراز والنبات المستجيب. في هذه الدراسة درسنا دور Rab5A وRab7A، سواء منظمات هامة لمسار الاتجار التقامي. علينا أن نبرهن على إسكات التعبير عن أي نتائج البروتين في انخفاض في translocatio المستجيبكفاءة ن. هذه الأساليب يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مسببات الأمراض داخل الخلايا وخارج الخلية الأخرى التي تستخدم أيضا أنظمة إفراز. وبهذه الطريقة، صورة عالمية من العوامل المضيفة المعنية في النبات المستجيب البكتيرية يمكن الكشف عنها.

لهذه الدراسة، وC. تم اختيار البورنيتية pBlaM-CBU0077 سلالة كما CBU0077 ثبت سابقا أن يكون المستجيب translocated من نظام إفراز الكوكسيلا نقطة / آي سي إم 17. قبل الإصابة، فإن العدد الإجمالي للجينوم / مل في سبعة أيام C. وقد عددت ثقافة البورنيتية<...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

التحقيق في التفاعلات بين مسببات الأمراض البكتيرية ومضيفيهم هو مجال هام من مجالات الأبحاث البيولوجية. هنا، نحن تصف التقنيات اللازمة لقياس النبات المستجيب من الكوكسيلا البورنيتية أثناء سيرنا إسكات الجينات باستخدام BlaM الركيزة.

تطبيق نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لدراسة المستجيب إزفاء الكفاءة من قبل<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; أثناء سيرنا إسكات

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

The overall goal of this experimental procedure is to examine the impact of specific host processes on the ability of bacterial pathogens to translocate effector proteins. This method can help answer key questions in the field of cellular microbiology. Specifically how the host is involved in either blocking or promoting the delivery of bacterial virulence effectors into the host cell.The main advantage of this technique is that it combines two established techniques. Namely, siRNA gene silencing and reporter essay to measure bacterial protein translocation. To investigate the interplay between pathogens and the eukaryotic cell.This method provides insight into coxiella pathogensis and can also be applied to investigate the host pathogen interactions of other bacteria that depend on efficient protein translocation. For example, chlamydia, salmonella, and attaching interfacing E.coli. After culturing C.burnetii expressing CBU0077, fuse the betalactamase according to the text protocol in a 25 centimeter squared culture flask with a vented cap.Inoculate 10 milliliters of pre-warmed ACCM2 containing three micrograms per milliliter of chloramphenical with 20 microliters of the bacteria. Grow the culture at 37 degrees celsius with five percent carbon dioxide and 2.5 percent oxygen for seven days. To reverse transfect hela cells with siRNA and after preparing the siRNA according to the text protocol, place DMEM plus 10%FCS, 05 percent trypsin EDTA, and PBS in a 37 degrees celsius water bath for 30 minutes to warm prior to use.For each experimental siRNA transfection, combine 0.4 microliters of transfection reagent and 63.6 microliters of reduced serum media in an individual microfuge tube. Vortex all microfuge tubes and allow the components to complex for five minutes at room temperature. Add 16 microliters of each experimental siRNA to the corresponding microfuge tubes containing the transfection complex.Then vortex and incubate at room temperature for 20 minutes. During the 20 minutes incubation, add 20 microliters of the transfection reagent, reduced serum medium and siRNA mix into the appropriate wells of a sterile black, flat, clear bottomed 96 well tray. Also during the 20 minute incubation, use 10 milliliters of pre-warmed PBS to wash a monolayer of confluent or subconfluent hela cells in a 75 centimeter squared flask.Add one milliliter of 05 percent trypsin EDTA solution to the flask and incubate at 37 degrees celsius and five percent carbon dioxide for three to five minutes to detach the cells. Collect the cells in nine milliliters of pre-warmed DMEM with 10%FCS. Using a hemocytometer to count the cells.Then with DMEM 10%FCS, bring the cells to a final density of 4.9 times 10 to the four cells per milliliter. Immediately following the 20 minute incubation, pipette 80 microliters of the cells into each well of the 96 well plate containing the siRNA transfection mixture which will bring the cell density to 3.92 times 10 to the third cells per well. This is the most critical step in the procedure.It is very important that the hela cells are added to the siRNA transfection mixture immediately following the 20 minute incubation. Otherwise transfection efficiency can be compromised. Ensure the blank wells contain only 80 microliters of DMEM plus 10%FCS.Incubate the plate for 24 hours. Then, with a multi-channel adapter attached to a vacuum source, and a pipette, replace the medium with 100 microliters of fresh DMEM plus 10%FCS. Incubate the cells for an additional 48 hours.After seven days of growth in ACCM2, centrifuge the 10 milliliters of C.burnetii P BlaM CBU0077 culture at 15, 000 times g and room temperature for 15 minutes. After removing the supernatant, use 10 milliliters of pre-warmed DMEM FCS to re-suspend the pellet. Then use water to prepare one in ten and one in one hundred dilutions in a final volume of 100 microliters of the culture and set up QPCR according to the text protocol.After calculating the total genomes per milliliter in the C.burnetii P BlaM CBU0077 culture, use pre-warmed DMEM FCS to adjust the volume of the culture to two milliliters for a concentration of 1.88 times 10 to the eight bacteria per milliliter. Next, remove the medium from the blank and reverse transfected cells. Then add 50 microliters of the diluted bacteria to the appropriate wells and add 50 microliters of DMEM FCS to the blank and uninfected wells.After preparing the solutions for the BlaM substrate according to the text protocol, prepare a master mix by combining 1.8 microliters of solution A and 16.2 microliters of solution B.Mix the tube well by vortexing. Then add 237 microliters of solution C and 45 microliters of 0.1 molar probenecid. Vortex the tube again.Add 10 microliters of the Six X loading solution directly into all the blank and reverse transfected wells without removing the existing medium. Incubate the plate in the dark at room temperature for two hours. To determine the level of translocation, on a microplate reader, create a fluorescence intensity protocol using Endpoint as the reading mode.Select 96 well microplate, then under optic settings, select two multichromatics and for the first number preset, input 410-10 nanometers excitation and 520-10 emission. For the second number preset, input 410-10 nanometers excitation and 450-10 emission. Then ensure Well multichromatics is selected.Next, select Orbital Averaging with a diameter of three millimeters. Under Optic, select Bottom optic. Then under Speed and Precision, select Precise.This corresponds to eight regions per well. Adjust the plate layout by selecting the appropriate wells as blanks and sample wells. Then, select Start measurement.Remove the lid and place the tray into the plate reader. Ensure the gain value is adjusted to avoid reaching maximum fluorescence values by performing a gain adjustment on one of the infected wells that has been reverse transfected with OTP siRNA. Select Start measurement to measure all the appropriate wells using Bottom fluorescence at an excitation of 410 nanometers and emission of both 450 nanometers and 520 nanometers for blue and green fluorescence respectively.Analyze the results according to the text protocol. This figure demonstrates an example of the cycle threshold value expected from both standards and samples following QPCR to determine the total number of genomes per milliliter in the seven day C.burnetii culture. Based on this data, there were 2.31 times 10 to the eight genomes per milliliter in the 10 milliliter re-suspended bacterial culture.The result to silencing either Rab5A or Rab7A on effector translocation from three independent experiments after incubation of the reversed transfected cells with BlaM substrate is shown here. A significant decrease in the level of BlaM CBU0077 translocation occurred during silencing of both Rab5A and Rab7A compared to OTP control. As demonstrated in this graph, although treatment with either Rab5A or Rab7A results in a reduction in cell viability compared to OTP control, this reduction is not as severe as treatment with PLK1, a gene known to cause cell death when silenced.After watching this video, you should have a good understanding of how to silence specific host targets using siRNA, and subsequently investigate the impact this has on bacterial effector protein translocation using FRET based reporter assay. This protocol has been optimized for both silencing of Rab GTPases in coxieller infection of hela cells. To utilize this method to target other host proteins, transfection conditions require optimization to ensure efficient gene silencing.Similarly to use this method with other bacterial pathogens, infection condition require optimization.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing