We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Virginia Tech Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dikkat: Bu protokolde kullanılan çeşitli parçaların kullanımında ve atarken aşırı önlemler alınmalıdır. Kullanmadan önce, kurumsal düzenlemeler ve iş sağlığı ve güvenliği uygulamaları yerel özellikle bir ağır metal ve radyoaktivite kaynağı ve kurşun nitrat hem uçucu ve son derece zehirli olan osmiyum tetroksit, uranil asetat, için, kurulmuş ve takip edilmelidir...

Sinir sisteminin karmaşıklığı, yeterli çözünürlüğe sahip mitokondri gibi büyük doku hacimleri yeniden ve morfolojisi ve organellerin dağılımı analiz önemli bir sorun teşkil etmektedir. Nöronlar, oligodendrosit ve üç boyutlu olarak uzatılmış çok sayıda süreçlerle astrositlerin dahil olmak üzere birden hücreler, beyin dokusu 43 içinde etkileşimde. Mitokondri hücreleri ve uzak süreçlerin soma hem de bulunduğu için, mitokondriyal morfolojisi sinir sistemi (Şekil 1)</...

Mitokondri hücre iskeleti ile sıkı etkileşim içinde, onların şekil ve hücresel ipuçları ve ihtiyaçlarına bağlı olarak konumunu değiştirmek dinamik organelleri vardır ve bu tür nöronlar 1 kalsiyum kanal akımlarının gibi hücresel olaylara yanıt olarak. Diğer hücre organelleri sırayla kendi dinamiklerini ve metabolizmasını 2 düzenleyen endoplazmik retikulum, örneğin ile mitokondri de etkileşim. Mitokondriyal morfolojisi yani farklı hücre tiplerinde heterojenitesini gösterir. organelle şekli bu levhalar, çuvallar ve oval 3 oluşan için boru şeklinde değişir. Mitokondriyal füzyon ve fisyon döngüsü proteinleri yer, boyut, şekil ve mitokondri 4 dağılımını düzenler gösterilmiştir. Ayrıca, mitokondriyal şekil değişimleri nörodejenerasyon, nöronal plastisite, kas atrofisi, kalsiyum sinyali, reaktif oksijen türleri üretimi gibi ömrü ve hücre ölümü karıştığı THA ile ilişkilidirT hücre spesifik mitokondriyal morfolojisi normal hücresel fonksiyonun 5-11 bakımı için kritiktir. Mitokondri önemli bioenergetic fonksiyonu TCA döngüsü yoluyla tam besin dağılımı (yani, glükoz, yağlı asitler ya da amino asitler) içerir ve OXPHOS 12 geçiş yolu, metabolik reaksiyonlar bir dizi yürüterek adenosin trifosfat (ATP) üretmektir. İnsan beyni vücut ağırlığının sadece% 2 ancak ~ o organı 13 zorlu bir derece enerji verme üretilen toplam enerjinin% 20&#39;sini tüketir oluşturmaktadır. İnsanlarda mitokondriyal fonksiyon bozukluğu, nörolojik belirtiler 14-17 çok sayıda yol açtığı şaşırtıcı değildir. Genetik ~ 1 bir prevalans ile bozuklukların klinik heterojen bir grup olan mitokondriyal hastalıkların 17,18, ATP nesil açar bozan OXPHOS bileşenleri mutasyonlar: 5.000 birey ve m en yaygın nedenlerinden biridirçocuklarda ve erişkinlerde etabolic bozukluklar. Mitokondri türevi ATP açığı, beyin, kalp ve iskelet kasları ağırlıklı bu hastalarda 14,17,18 de etkilenen gibi yüksek enerji gerektiren organları ile çoklu organ sistemleri etkiler. Son yıllarda, birçok çalışma nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların 15-17,19,20 hem mitokondriyal disfonksiyon için kanıtlar sağlamıştır. mitokondri temel ve beyin gelişimi ve işlevi için kritik olduğundan, hem sağlıklı ve hastalıklı devletlerin altında beyin mitokondriyal morfoloji, yapısı, büyüklüğü, sayısı ve dağılımında değişikliklere analiz protokolleri geliştirmek zorunludur. Mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteini (GFP) sıçan modelleri beyin 21,22 mitokondriyal hareketleri ve lokalizasyon görselleştirmek için üretilmiştir. Bu mitokondriyal hareketliliği ve genel dağılımını incelemek son derece yararlı bir araç olsa da, includ bazı dezavantajları vardırE sınırlı çözünürlük ve floresan mikroskobu duyarlılığı. Bu nitelikler zor nispeten küçük ölçekli mitokondri izlemek için yapmak. Benzer şekilde, seri transmisyon elektron mikroskobu başarıyla sinaptik mitokondri 23 görüntülemek için kullanılan, ancak bu yöntem çok zaman alıcı değil. Mitokondriyal morfoloji, sürekli fizyon ve füzyon döngülerine tabi olarak son derece dinamik olduğu bilinmektedir ve çoğu hücrelerde mitokondri son derece bağlı bir ağ 24-26 korumak olduğunu. Nöronlar çok onlar bu neurites yollarını (Şekil 1) yapmak gibi ayrı gerekebilir birden dendritler ve genişletilmiş akson ve hücre gövdesinde bağlı bir retiküler ağ oluşturmak mitokondri hücreleri polarize edilir. Bu boyut ve şekil son derece çeşitli beyin mitokondri yapar. Örneğin, bir seri bloğu yüz tarama elektron mikroskobu kullanılarak (SBFSEM) tekniği, daha önce gözlenen extrasynaptic mitochondr hacmi ya da boyut olarak farklılıkon altı 27 kat olarak sinir uçlarında bulunan mitokondri ia kadar olabilir. Sesi gerçekleştirmek için çeşitli yaklaşımlar vardır ultramicrotome SEM 30 toplama seri bölüm TEM 29, otomatik bant içeren, 28 analizleri, iyon ışın SEM 31 ve SBFSEM 32 duruldu. SBFSEM analizi, beyin 1 mm&#39;ye kadar alanda mitokondri gibi morfolojik şekil, boyut, dağıtım ve organellerin sayısal verisi sağlamak için çözünürlüğü sahip olduğu avantajlara sahiptir. Teknik çalışma bir önceki EM deneyim eksikliği birçok biyolojik laboratuvarlar yetenekleri dahilinde veri toplama ve analizi ile, aynı zamanda en az talep ediyor. Seri bölüm benzeri görüntüler üretmek için ticari araçların gelişi dokuların 3D ultrastrüktürel analiz yapmıştır ayrıca hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde 28 tarafsız bir hacimsel analizini veren bir rutin teknik, </&gt; Sup. SBFSEM sonra ilk nöronal devrenin 34 rekonstrüksiyonu analizinde önemli bir araç olarak bu tekniği kurduk 1981 yılından bu yana 33. Birden çalışmalarda Leighton tarafından tanıtılan bir fikrine dayanan, 2004 32 nörobiyoloji alanında tanımlanan ve kullanılmıştır. Ayrıca, birçok küçük ölçekli projeler için, hücresel organellere 27,35-39 belirlemek için yeniden analiz sağlar. Bu yana, edinilen görüntüler alçak gerilim geri saçılım elektron türetilmiştir, bilinen farklı ağır metal boyama tekniklerini birleştiren yeni boyama protokolleri çözünürlüğü 40 artırmak için geliştirilmiştir. Bu yazıda, 3D elektron mikroskopi görüntüleme ve daha önce bize ve diğerleri 38,39,41 tarafından kullanılmış olan yöntemlere dayalı beyin mitokondri hacimsel analizini kullanan bir protokol sağlar. Doku sonrası işleme yöntemleri, daha önce Deerinck ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir kullanılan40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, tradename Fluriso</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>S65105&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly canula</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.45 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NC0813356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome sectioning system</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>Vibratome 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% Solution</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>43731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed-812 EMBEDDING KIT</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td>Contains Embed 812&#160; resin, DDSA, NMA, and DMP-30.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% EM Grade</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>20400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum specimen pin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Silver Liquid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234790</td>
			<td>Hardware/craft stores carry this item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive epoxy</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>16043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Sigma VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In chamber ultramicrotome for SEM</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3View2</td>
			<td>Can be designed for other SEMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming microscope for pin preparation</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td colspan="2">supplied as part of 3View system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low kV backscattered electron detector</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3V-BSED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/ Fiji processing package&#160;</td>
			<td colspan="2">ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td>
			<td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy

İnsan beyni ağırlıklı bir yakıt kaynağı olarak glikoz dayanan bir yüksek enerji tüketen organdır. Glukoz adenosin trifosfat (ATP) şeklinde hücresel enerji üretmek için glikoliz, tri-karboksilik asit (TCA) döngüsü ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) yollar ile beyin mitokondrilerde katabolize edilir. mitokondriyal ATP üretimi düşüklüğü belirgin nörolojik ve myopatik semptomlar ile klinik mevcut mitokondriyal bozukluklar neden olur. Mitokondrial kusurlar da nöro bozuklukları (örneğin otizm spektrum bozukluğu) ve nörodejeneratif bozukluklarda mevcut (örneğin, amiyotrofik lateral skleroz, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları). Böylece, sağlıklı ve hastalık durumları hem altında mitokondriyal morfolojisi, yapısı ve dağıtım 3D analizini gerçekleştirmek için alanında artan bir ilgi var. Beyin mitokondriyal morfoloji özellikle bazı mitokondri ile bu son derece çeşitlidirsinaptik bölge geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü sınırının altındadır &lt;200 nm çaplı aralığında olmak. beyinde mitokondriyal hedeflenen yeşil floresan proteinini (GFP) ifade anlamlı konfokal mikroskopi ile organel algılama arttırır. Ancak, büyük ölçekli mitokondri görüntüleri oversaturating olmadan nispeten küçük ölçekli mitokondri saptanmasının duyarlılığı üzerindeki kısıtlamaları aşmak değil. seri geçirimli elektron mikroskobu başarıyla nöronal sinaps mitokondri karakterize etmek için kullanılmış olsa da, bu teknik son derece zaman alıcı birden fazla numune karşılaştırırken özellikle olduğunu. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBFSEM) tekniği, doku ve veri toplama görüntüleme blokları kesit bir otomatik süreç gerektirir. Burada, hızla yeniden ve mitokondriyal morfolojisi görselleştirmek için kemirgen beyin tanımlanmış bir bölgenin SBFSEM gerçekleştirmek için bir protokol sağlar. bu teknolojinique da tanımlanan bir beyin bölgesi mitokondriyal sayısı, hacmi, boyutu ve dağılımı üzerindeki doğru bilgi temin etmek için kullanılabilir. Elde edilen görüntü çözünürlüğü (genellikle 10 nm altında) yüksek olduğundan herhangi bir brüt mitokondriyal morfolojik bozukluklar da tespit edilebilir.

Beyin mitokondriyal morfolojisi ve boyutu farklı nöronal alt bölümlerinde heterojen olduğunu göstermektedir. Lentivirüs mitokondriyal hedefli yeşil flüoresan protein ifade ile dönüştürülmüş düşük yoğunluklu nöronal kültürlerinde mikroskopisi uzak neurites kalanların ayrı uzatılmış morfoloji (Şekil 1 AB) sergilemek ise nöronal soma ikamet eden mitokondri, bir retiküler ağ oluştururlar olduğunu gösterdi. SBFSEM teknik kullanılarak, mitok...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

The overall goal of the serial block-face scanning electron microscopy technique is to analyze mitochondrial morphology, structure, distribution, volume, and number in a defined region of the mouse brain. This method can help answer many key questions in neurobiology, such as whether changes in brain mitochondria structure, number, and distribution contribute substantially to neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. The main advantage of this technique is that it automates the process of imaging serial sections by incorporating a custom ultramicrotome built into the low vacuum scanning electron microscope chamber.To begin the experiment, wash the previously prepared glutaraldehyde-fixed tissues three times for five minutes each in 0.1 molar cacodylate buffer. Post-fix the tissues with 1 milliliter of cacodylate buffered 0.1%tannic acid for 30 minutes at room temperature. After post-fixing, wash the tissues in cacodylate buffer.Dissolve 0.3 grams of potassium ferrocyanide and 0.86 grams of sodium cacodylate in 10 milliliters of distilled water. Just before use, add 10 milliliters of 4%osmium tetroxide and stain the tissues with 2%osmium ferrocyanide solution for 90 minutes on ice. After staining, wash the tissue in distilled water.Treat the samples with freshly prepared 1%thiocarbohydrazide or TCH solution for 20 minutes at room temperature. Then wash the samples. Next, stain the tissues with 2%aqueous osmium tetroxide for one hour.After staining, wash the tissues with distilled water. Incubate the samples overnight in 1%uranyl acetate in distilled water at 4 degrees Celsius. The next day, rinse the tissues in distilled water and incubate them with Welton's lead aspartate stain in an oven.Obtaining the best possible stainings of tissues is critical to imaging, as poor staining results in a charging phenomenon on the sample that makes imaging difficult or impossible. Wash the tissue in distilled water. Dehydrate the samples through a graded series of alcohol using chilled solutions of ethanol for five minutes each, followed by a 100%ethanol dehydration three times for 10 minutes each.Wash the samples two times for 15 minutes each in propylene oxide. Place the tissues in a 1:1 mix of embedding resin and propylene oxide, cap the vial, and incubate the tissues overnight. Uncap the vial after two hours so that the propylene oxide evaporates over the nine-hour period.Transfer the tissues to 100%fresh embedding resin in clean vials for two hours. Embed the samples in fresh embedding resin in flat molds containing printed paper labels and cure them in an oven. After one hour, check the tissue placement and alignment and adjust if necessary.Trim the samples to the area of interest and mount them onto an aluminum pin using gelling cyanoacrylate super glue. Then coat the sample with colloidal silver paste around the sides of the block to provide a conductive path to the aluminum pin. Examine the tissue specimens using a scanning electron microscope system equipped with an in-chamber ultramicrotome stage and a low kilovolt backscattered electron detector.Image the samples with these settings. Begin analysis by selecting Image, Type, then 8-bit to convert the images to 8-bit TIFF format from the original proprietary 16-bit. If automatic contrast and/or brightness conversion during this step is not ideal for images, reopen the 16-bit images and press Image, Adjust, Brightness/Contrast.Select a range that works for all images and press Apply. Then perform the conversion. If there was unacceptable image movement between slices, align the image stacks by selecting Plugins, Registration, and Linear Stack Alignment with SIFT and set the alignment for translation-only mode rather than rigid body.Enlarge the canvas size prior to registration by selecting Image, Adjust, Canvas Size. Alternatively, reduce the image to an area of interest by selecting the desired region and then cropping it. If necessary, scale images to a smaller, more manageable size using ImageJ, then selecting Image and Scale.Confocal microscopy on low-density neuronal cultures showed that mitochondria residing in neuronal soma form a reticular network, whereas those residing in distal neurites exhibit a discrete elongated morphology. Using the serial block-face scanning electron microscopy, or SBFSEM technique, the mitochondria, dendrites, and axonal varicosities were clearly observed in the mouse brain. Three-day reconstructions of mitochondria in the neurites of mouse brain tissue displayed a difference in size between dendritic and axonal mitochondria.Data extracted from a representative 2-D SBFSEM image revealed that the volume or size of mitochondria residing within the neuronal presynapses was significantly smaller than those residing in the extrasynaptic region. The images acquired by SBFSEM analysis provide increased resolution to visual the ultrastructural characteristics of individual mitochondria. It is possible to classify the cellular compartment of mitochondria by determining its proximity to readily identifiable structures like non-synaptic somatic mitochondria and presynaptic mitochondria.This technique can be done in about seven days, which includes three days of staining, two days for resin curing, one day of imaging to produce a stack suitable for this analysis, and about two to four hours for image post-processing in preparation for the analysis. This procedure can also be used in conjunction with other methods for imaging mitochondria such as live imaging with genetically labeled mitochondria to answer questions about mitochondrial trafficking and the dynamics of their fission and fusion.