We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

תמלול 1. במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize וקטורים pCS2-H2A.F / Z-EGFP ו / או pCS2-mCherry-CAAX ידי הגבלה NotI האנזים לעכל 31. שימוש RNA בערכת שעתוק במבחנה, ליצור מוצרי mRNA 5 &#39;כתרים מכל תבנית, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rt...

השימוש בשיטה זו מאפשר להסיק פירוט מעטפת הגרעין, היווצרות של צלחת metaphase ידי קבצים מצורפים microtubule-קינטוכור, והפרדה של כרומטידה אחות ליצירת שני תאים חדשים vivo ובאופן שהזמן גרמן. היכולת להתבונן מיטוזה דג הזברה יש יתרון על פני דגימות קבועות ומערכות תרבית תאים כי ה...

מיטוזה הוא חיוני בתהליכים תאיים קריטי לצמיחה, בידול, והתחדשות בכל יצור חי. עם הכנה מדויקת שכפול של דנ&quot;א ביניים, התא ערוך לחלק. השלב הראשון של מיטוזה, prophase, הוא שיזם ההפעלה של cyclin B / Cdk1. Prophase מאופיין עיבוי של חומר הכרומטין לתוך הכרומוזומים. פירוט המעטפה גרעיני מתרחש במעבר בין prophase ו prometaphase. בשנת prometaphase, centrosomes, במרכז nucleating להיווצרות ציר, להתחיל להגר הקטבים תוך הארכת microtubules בחיפוש מצורף קינטוכור. עם קובץ מצורף, המרות קצה בדבר עיקול microtubule וכוחות המתח לכוון את הכרומוזומים להרכיב צלחת metaphase 1. אם כל הכרומוזומים מחוברים כהלכה, מחסום הרכבת הציר בא על סיפוקו, טבעות cohesin מחזיקות את כרומטידה האחות יחד הם בקעו, ו microtubules לקצר למשוך אחותוכרומטידה כדי קטבים מנוגדים במהלך anaphase 2,3. השלב הסופי, telophase, כרוך התארכות התא הרפורמציה של מעטפת הגרעין סביב שני הגרעינים החדשים. Cytokinesis משלים את התהליך החלוקה על ידי הפרדת הציטופלסמה של התאים הבת החדשים שני 4-6. שינוי מסלולי mitotic מפתח (כלומר, מחסום הרכבת ציר, שכפול centrosome, לכידות כרומטידה אחות, וכו.) יכול לגרום למעצר metaphase, missegregation של הכרומוזומים, 7-10 יציבות גנומית. בסופו של דבר, פגמי מיטוזה שליטת מסלולים יכולים לגרום פרעות התפתחותיות וסרטן, ויזואליזציה מחייב של מיטוזה והפגמים שלה חי, חוליות, רב תאי אורגניזם 10-16. עוברי דג הזברה לשרת כאורגניזם מודל נהדר עבור הדמיה לחיות בשל רקמה שקופה, קלות microinjection, ופיתוח מהיר. שימוש דג זברה, המטרה הכוללת של כתב היד הזה היאמתארים שיטה של 5D חי (מידות X, Y, Z, זמן, אורך הגל) הדמיה של מיטוזה 17 (תרשים 1C). שימוש מוטצית דג הזברה פגומה במסלולי mitotic שונים להדגים התוצאה של פגמים כאלה. עבור פרוטוקול זה, מוטציות אורורה B ו- Esco2 נבחרו כדי להמחיש את הפגמים הללו. אורורה B הוא קינאז כי הוא חלק מקומפלקס נוסעים כרומוזום (CPC) המעורבים ביצירת ציר והתקשרות microtubule. היא נדרשת גם להיווצרות הקמט מחשוף ב cytokinesis 18,19. בשנת דג הזברה, מחסור ב אורורה מוביל פגמים אינדוקציה תלם, cytokinesis, וכרומוזום הפרדה 20. Esco2, ומצד שני, הוא acetyltransferase כי הוא חיוני עבור לכידות כרומטידה אחות 21,22. זה acetylates cohesin על החלק SMC3 של הטבעת ובכך מייצב cohesin כדי להבטיח הפרדה כרומוזום נכונה במעבר metaphase-anaphase 23. אובדן Esco2 דג הזברה מוביל CHmissegregation romosome, הפרדת כרומטידה אחות מוקדמת, חוסר יציבות גנומית, ו- p53 תלוי אפופטוזיס עצמאית 24,25. בשל הזמינות, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה (להלן המכונה aurB מ / מ &#39;esco2 מ / מ&#39;, בהתאמה) ישמש כדי להמחיש את הטכניקה הזו 25-27. מיקרוסקופיה זיווגי confocal עם מכונות תא ניאון מתויגות אפשרה לחוקרים לחזות דינמיקת הכרומטין קרום התא במהלך מיטוזה 25,28,29. פלורסנט מתויג היסטונים שימשו היסטורית לדמיין הכרומטין. ההיסטונים הם חלבונים גרעיניים מורכב מארבעה זוגות שונים (H2A, H2B, H3, H4 ו) כי הם אחראי המבנה הנוקלאוזום כי מלחינת כרומוזומים 30. בעוד H2B הוא לטעון את היסטון השימושי ביותר עבור חלבוני ניאון בהעכבר תרבית תאים, השימוש היסטון 2A, Z משפחה (H2A.F / Z) הוכיח גם לשימוש 31,32 דג הזברה. Concanavalin A ו- קזאין קינאז 1-גמא למשל, למקם את קרום התא בעבר הוכח יעיל לדמיין את קרום תא קיפודי ים תסיסנית 33,34. מחקרים אחרים הראו כי חלבון פלואורסצנטי מתויג CAAX תוויות קרום התא היה מוצלח דג זברה 31. CAAX הוא מוטיב כי הוא מוכר על ידי אנזימים שינוי שלאחר translational כגון farnesyltransferases ו geranylgeranyltransferases. שינויים על ידי אנזימים אלה לגרום חלבונים להפוך קרום קשור, ובכך תיוג קרום התא 35. בשל השימוש לפני דג זברה, פרוטוקול זה בחר להשתמש H2A.F / ת ו CAAX לתייג הכרומטין קרום התא. יישום של שיטה זו יאפשר החוקר לפקח מיטוזה ברמת התא היחידה להתבונן כרומוזום פרטדינמיקה, וכן בו זמנית לפקח חלוקות תא מרובות עלולים להשפיע בידול רקמות ופיתוח. מאמר זה יתמקד הדמית הדינמיקה של פרדה כרומוזום במהלך מיטוזה ברמת התא היחידה. בתוך כתב היד הזה, את היכולת להתבונן כמה חטיבות mitotic, לחשב זמן חלוק, ולפענח פנוטיפים mitotic שתודגם ודנה. באמצעות פרמטרים אלה, נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ניתן לאסוף להחיל מצבי מחלה כמה מושפע פגמים mitotic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pCS2 vectors</td>
			<td style="width:175px;">Gift from K. Kwan</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:460px;">For plasmid of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:175px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>For restriction digest of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">mMessage SP6 kit</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>For in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">74104</td>
			<td style="width:460px;">For purifying mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 x 15 mm petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">FB0875712</td>
			<td>For housing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microinjection mold</td>
			<td style="width:175px;">homemade</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For holding embryos during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose II</td>
			<td style="width:175px;">Amresco</td>
			<td style="width:129px;">0815-25G</td>
			<td>For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tricaine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>For anesthetizing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">S9888</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">P3911</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C8106</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">M7506</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Methylene Blue Hydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">MB1</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 mm culture tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-819-812</td>
			<td>For melted agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">35 mm glass coverslip bottom culture dish&#160;</td>
			<td style="width:175px;">MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-20-C&#160;</td>
			<td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">#5 tweezers</td>
			<td style="width:175px;">Dumont</td>
			<td style="width:129px;">72701-D</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">21G 1 1/2 gauge needle&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:129px;">305167</td>
			<td>For positioning embryos in agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon AZ100</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon A1+</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal software</td>
			<td style="width:175px;">NIS Elements AR 4.13.00</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

מיטוזה היא קריטית לצמיחה האורגניזם והבחנה. התהליך הוא מאוד דינמי ומחייב הורה אירועים להשיג עיבוי הכרומטין נכון, מצורף קינטוכור-microtubule, פרדה כרומוזום, ואת cytokinesis בתוך מסגרת זמן קטנה. שגיאות בתהליך העדין יכולות לגרום מחלות אנושיות, כוללים מומים מולדים וסרטן. גישות מסורתיות חוקרות מצבי מחל mitotic אדם לעתים קרובות מסתמכות על מערכות תרבית תאים, אשר חסרים את הפיסיולוגיה הטבעית בהקשר התפתחותי / רקמות ספציפיות יתרון כאשר לומדים מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתגבר על מכשולים רבים על ידי מתן דרך לחזות, עם רזולוציה גבוהה, דינמיקת כרומוזום במערכת החולייתנים, דג הזברה. פרוטוקול זה יפרט גישה, שניתן להשתמש בם כדי להשיג תמונות דינמיות של תאים מתחלקים, הכוללים: במבחנת שעתוק, רביית דג זברה / איסוף, הטבעה עוברת, ולאחר הזמן לשגות הדמיה. אופטימיזציה modifications של פרוטוקול זה גם נחקר. שימוש H2A.F / Z-EGFP (תוויות הכרומטין) ו mCherry-CAAX (קרום התא תוויות) עוברים מוזרק mRNA, מיטוזה ב AB wild-type, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה הוא מדמיין. הדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של דג זברה מאפשרת להתבונן mitoses המרובה לכמת פגמי mitotic סטטיסטיים ועיתוי של התקדמות mitotic. בנוסף, תצפית של היבטים איכותיים המגדירים תהליכי mitotic פסולים (כלומר, פגמי congression, missegregation של כרומוזומים, וכו &#39;) ותוצאות כרומוזומליות פסולות (כלומר, aneuploidy, polyploidy, גרעינונים, וכו&#39;) הם נצפו. assay זה יכול להיות מיושם על תצפית של / בידול רקמת פיתוח הוא נוח לשימוש דג הזברה מוטציה וסוכני תרופתי. ויזואליזציה של כמה פגמים מיטוזה להוביל להפרעות סרטן והתפתחותיות יהיה מאודלשפר את ההבנה של בפתוגנזה של המחלה.

<html> איור 2 מדגים את היכולת להתבונן חלוקות תא רבות באמצעות תצוגת שדה רחב של זנב דג הזברה wild-type AB. במשך שבע התאים mitotic הם צילמו בתוך מסגרת זמן 14 דק &#39;(סרט 1). בתוך מנות זמן שני hr, למעלה מ -40 אירועים mitotic נתפסו. בממוצע, 50 תאים מתחלקים נצפו AB ו ...

Watch this Scientific Journal Video about Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo at JoVE.com

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

The overall goal of this procedure is to monitor the fidelity of chromosome segregation during mitosis in a live zebrafish embryo by using flourescently labeled chromatin and cell-membrane proteins that will be captured using high-resolution confocal microscopy. This method can help answer key questions in the mitosis field, such as how do mitotic defects result in a developmental defect, or tumor formation in a live vertebrate organism? The main advantage of this technique is that we are observing mitosis in a live vertebrate organism that allows phsyiologically relevant data to be collected.After breeding adult zebrafish and injecting eggs with H2A. F/Z-EGFP and/or pCS2 mCherry-CAAX RNA, approximately two hours before imaging, use a fluorescent dissecting microscope to identify GFP-positive embryos. Transfer bright green, GFP-expressing embryos into a new, 100 by 15 millimeter Petri dish with E3 blue medium.Boil a stock solution of 1%low-melt agarose in E3 blue. Aliquot three milliliters of the melted agarose into a 17 by 100 millimeter culture tube. Keep the agarose warm by placing the culture tube in a 42-degree Celsius water bath until ready for use.Gather 15-millimolar tricaine, screened embryos, low-melt agarose, E3 blue, and a 35-millimeter glass coverslip-bottom culture dish, and a dissecting light microscope. Next, with number five tweezers, carefully remove the chorions from three embryos, and place the embryos in a separate container to be anesthetized. Then, using a transfer pipette, add three drops of 15-millimolar tricaine into the dish containing the embryos and five milliliters of medium.Add three to four drops of 15-millimolar tricaine solution to the tube of 1%melted agarose. When the embryos are sufficiently anesthetized, using a P200 Pipetman, with one centimeter of the pipette tip cut off, transfer the anesthetized embryos to the coverslip-bottomed dish. Remove any excess E3 blue tricaine solution.Slowly add five to 10 microliters of low-melt-agarose-tricaine solution over the embryos, keeping each drop separate, to ensure that the embryos do not drift close to one another. Then, using a 21-gauge one-and-a-half needle, gently orient the embryos in the agarose to the desired position, orienting the region of interest as close to the coverslip as possible if using an inverted microscope. Due to the shifting that may occur, it may be necessary to return to each embryo to make sure they stay in the required position.This may have to be done multiple times, til the ideal position is achieved as the agar solidifies. After a few minutes, to test if it is set, use a needle to break apart a small piece of agarose. When it can be pulled away from the drop, use additional low-melt agarose to form a dome over the embedded embryos, covering the entire coverslip.While the agarose solidifies, prepare three milliliters of E3 blue medium with five drops of 15-millimolar tricaine, to be placed over the embedded embryos during imaging. To carry out 5D confocal imaging of live zebrafish embryos, open the imaging software, and set the microscope to a 60X numerical aperture 1.4 lens. Apply immersion oil to the lens, and place the culture dish in the slide holder on the microscope stage.Using the axis controller, center the embryo of interest above the objective lens, and raise the lens to meet the culture dish. Pour E3 blue and tricaine solution over the agar-embedded embryos. Next, click on the Eye Port icon to view embryos through the eyepiece.Disable the Eye Port selection, and choose View, Acquisition Controls, A1 Scan Area, to open the A1 Scan Area tool. Select the GFP channel, restart the scan, and focus on a region of interest close to the coverslip. Stop the scan, select the GFP and mCherry channels, and set the line-averaging option to normal.Now, choose View, Acquisition Controls, ND Acquisition, to open the A1 ND Acquisition tool. Begin scanning. Then, using the axis controller, position the embryos so that the scan area is filled with as much of the zebrafish as possible.Set the Z-stack upper limit to where the cells are out of focus, allowing for an extra three micrometers of space above the sample, for growth and cell movement. Then, set the lower limit to where the cells are no longer visible, and set the Z-interval step size to two micrometers. For the experiments demonstrated here, adjust the imaging laser power, HV or gain, and offset levels, respectively, as listed below.Once the parameters are set, shut off the scan to prevent unnecessary laser exposure that may cause phototoxicity and photobleaching of the sample. Now, select the 2X line averaging icon, which provides the best image quality and fastest scan time. Select the appropriate time interval and time duration necessary for the experiment.For wild-type cell divisions, two minute time intervals for a duration of two hours is adequate for determining mitotic duration. Divisions that activate the spindle assembly checkpoint for longer than thirty minutes are more suitable for four-to-five-minute intervals for four hours, in order to preserve flourescense, as demonstrated here. To automatically save the file as it is being acquired, check the Save to File box, and name the file.Finally, double-check that all parameters are set correctly, and hit Run Now. After acquisition is complete, to view the file in a three-dimensional format, click on the Volume Threshold icon. This figure demonstrates the ability to observe many cell divisions using a wide field of view of an AB wild-type zebrafish tail.The cell divisions are denoted by asterisks. The corresponding movie is shown here. On average, 50 dividing cells in AB, and 30 dividing cells in the aurora B mutant were observed.To account for the reduced number of mitotic cells imaged in the aurora B mutant embryo, the ratio of mitotic cells to the number of cells imaged was calculated, suggesting that there is not a lower number of cells going through mitosis in the aurora B mutant embryos, but, rather, a fewer number of total cells being imaged. To quantify mitotic duration, the number of time intervals that take up one cell division are multiplied by the interval of time between each Z-stack. As revealed in this graph, the average AB wild-type division time is 25 minutes, and 58 minutes for the aurora B mutant.As seen in wild-type embryos, each mitotic phase can be distinguished. However, mitotic defects are observed in the aurora B mutant embryo, which include mitotic arrest and filed cytokinesis, resulting in a binucleated cell, and subsequent formation of micronuclei, which support the increased division time measured in this mutant. Once mastered, this technique can be done in one hour, from screening embryos to setting up the confocal microscope parameters.While attempting this procedure, it's important to remember the context of the experiment at hand, as it pertains to the region of interest, time duration, time interval, and Z-depth. This will help maximize efficiency, as well as prevent photobleaching and phototoxicity. Following this procedure, other methods, like chromosome spreads, can be performed to answer additional questions about the cause of mitotic defects observed, or use of a drug treatment to determine the effects on mitotic progression, duration, or cell fate.After its development, this technique paved the way for researchers in the field of biology to explore mitosis in the context of developmental and cancer biology using zebrafish. After watching this video, you should have a good understanding of how to embed zebrafish embryos, capture live imaging of mitosis, and analyze mitotic frequency, duration, and cell fate. Don't forget that working with high-powered lasers and fluorescent light can be detrimental to the eyes, and precautions, such as avoiding direct eye contact with the lasers, should always be taken while performing this procedure.