Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud DP2OD008470. Derudover RAM blev delvist understøttet af midler fra University of Notre Dame Graduate School. Vi takker stabe af Biologisk Institut, Center for zebrafisk Research, og Center for stamceller og regenerativ medicin ved University of Notre Dame. Vi takker især medlemmerne af lab for at engagere diskussioner om nyre biologi og deres nyttige feedback på dette arbejde.

Procedurerne for at arbejde med zebrafisk embryoner er beskrevet i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Notre Dame. 1. Fremstilling af opløsninger <ol><li> Lav en 50x stamopløsning af E3 embryo medier ved at blande 73,0 g NaCl, 3,15 g KCI, 9,15 g CaCl2, og 9,95 g MgSO4 i 5 liter destilleret vand, og opbevar ved stuetemperatur. </li><li> For dyrkning af zebrafisk embryoner, fortyndes 50x stamopløsningen af ​​E3 foster medier lage...

En mangfoldig række af terapeutiske midler er blevet forbundet med AKI 29. Der har været en betydelig forskningsindsats fremskridt i forståelsen af skader fremkaldt af mange individuelle forbindelser, såsom aminoglykosid gentamicin 30 og udbredte kemoterapeutiske cisplatin 31,32. Nogle patologiske forandringer, der er involveret i disse forhold, dog fortsat genstand for igangværende studie. En emergent udfordring er stadig at forstå, hvordan flere lægemidler påvirker patienterne,...

AKI er en brat tab af nyrefunktion, som kan føre til ødelæggende sundhedsmæssige konsekvenser 1. AKI er en betydelig sundhedspleje problem på verdensplan på grund af sin høje forekomst på ca. 20% blandt hospitalsindlagte patienter, med endnu højere 30-50% i kritiske tilfælde pleje og ældre, og dødelighed på 50-70% 1-3. Desværre har forekomsten af ​​AKI været stigende og forventes at eskalere yderligere i det næste årti, dels på grund af mangfoldigheden af ​​faktorer, der kan fremkalde AKI, som omfatter postoperativ stress, iskæmi, og udsættelse for nefrotoksiner såsom antibiotika og kemoterapeutiske lægemidler 4. AKI indebærer pludselig cellulære skader i nyrerne, almindeligt forekommende i nefroner, som er de væsentlige funktionelle enheder, og er sammensat af en blod-filter og en segmenteret tubulus der dræner urin i centrale indsamling kanaler 1. Når et betydeligt antal nefroner erbeskadiget under AKI, de umiddelbare virkninger omfatter en afbrydelse i affald clearance fra kredsløbet, og reduceret eller ophævet flow væske gennem nefroner grundet obstruktion fra døde og døende celler 1. Over tid, kan rørformede obstruktion føre til degeneration af hele nefroner, der permanent reducerer nyrefunktionen 1. Fysiologiske ændringer i nyrerne efter AKI involverer også komplicerede inflammatoriske begivenheder, der kan føre til kronisk ardannelse 1. På trods af disse resultater, nefroner har nogen kapacitet til at undergå regeneration efter AKI der genopretter den tubulære epitel 5,6. Mens der har været en stigende molekylær forståelse af nephron regenerering, mekanismerne forblive undvigende i mange henseender og nødvendiggør fortsatte efterforskning 7. I hvilken grad AKI resulterer i permanent nyreskade også fortsat ukendt. Aktuel forskning tyder den regenerative potentiale for nyren erhøjeste følgende mindre alvorlige tilfælde af AKI, mens mere udtalte eller gentagne episoder føre til kronisk nyresygdom (CKD), og kulminerer i terminal nyresygdom (ESRD), der kræver livreddende transplantation eller dialyse 8,9. Derudover individer allerede lider CKD er på et endnu større risiko for at pådrage sig en alvorlig episode af AKI 8,9. Tilsammen er det klart, at fortsat grundforskning og klinisk forskning er afgørende for at forstå, behandle og forebygge AKI. Forskning med dyremodeller har været medvirkende til at værdsætte progression af lokale og miljømæssige forandringer, der opstår i løbet af AKI 10. At udvide denne forståelse samt udvikle nye behandlinger har zebrafisk dyremodel været ansat i en række forskellige måder 11,12. De nefroner af zebrafisk nyre, i både embryo og voksne, viser en høj grad af bevaring med pattedyr 13-16. Endvidere nephron epitelial skade i zebrafish ligner processen i højere hvirveldyr, hvorved den lokale ødelæggelse af rørformede celler efterfulgt af intratubulær proliferation og reetablering af nephron arkitektur 17-19. I embryonet imidlertid omfattende tubulus skader fra de nefrotoksiner som cisplatin er forbundet med letalitet 20,21. Til sammenligning zebrafisk voksne overlever AKI og udviser væsentlige regenererende kapaciteter i nyren. For eksempel, efter udsættelse for aminoglykosid antibiotikum gentamicin, zebrafisk regenerere tubulus epitelial skader og vokse nye nefronenheder samt 22-24. Mens disse gentamicin-induceret AKI undersøgelser har givet uvurderlige oplysninger, forståelse nyreskade fra forskellige nefrotoksiner fortsat kritisk at værdsætte virkningerne og reaktion på forskellige typer af skader 25. Zebrafisken embryo, på grund af sin størrelse, gennemsigtighed, og genetisk medgørlighed, har mange fordele for nephrotoxin undersøgelser &lt;sup&gt; 25, hvor der anvendes fremgangsmåden til mikroinjektion 20,21 at administrere molekylet (er) for undersøgelsen. Nefroner er dannet af 24 timer efter befrugtning (HPF) og begynder at filtrere blod ved ca. 48 HPF 26,27. Således er den hurtige dannelse og funktion af det embryoniske nyre letter eksperimentel analyse. Men processen med mikroinjektion har tekniske udfordringer, og der kan være en stejl indlæringskurve at beherske teknikken. I denne video artiklen beskriver vi, hvordan du udfører mikroinjektioner og giver tips til fejlfinding for at øge hastigheden af ​​succesfulde injektioner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:129px;">AB01915</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;(microinjection tray) 150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micrometer</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>2280-24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

Nyrerne er modtagelige for skade fra eksponering for kemikalier, de filtrerer fra blodbanen. Dette kan føre til orgel skade i forbindelse med et hurtigt fald i nyrefunktion og udvikling af det kliniske syndrom kendt som akut nyreskade (AKI). Farmakologiske midler anvendt til behandling af medicinske omstændigheder spænder fra bakteriel infektion til kræft, når det administreres individuelt eller i kombination med andre lægemidler, kan initiere AKI. Zebrafisk er en nyttig dyremodel til at undersøge de kemiske virkninger på nyrefunktionen in vivo, da de udgør et embryonisk nyre bestående af nephron funktionelle enheder, som er konserverede med højere hvirveldyr, herunder mennesker. Endvidere kan zebrafisk udnyttes til at udføre genetiske og kemiske skærme, som giver mulighed for at belyse de cellulære og molekylære facetter af AKI og udvikle terapeutiske strategier såsom identifikation af nephroprotective molekyler. Her udviser vi hvordan mikroinjektion ind izebrafisk embryo kan anvendes som et paradigme for nephrotoxin studier.

En mikroinjektion station oprettet indbefatter et stereomikroskop, mikromanipulator og trykregulatoren (figur 1A). Gennemlysning af injektionspladen er at foretrække at se prøver under denne procedure (figur 1B). Forberedelse af kanylen indebærer at trække den relevante borosilikatglas, efterfulgt af at forberede kanten med opskæring og endelig rygbelastende nålen. Optimalt er nålespidsen affaset stedet blunt (figur 1C), et snit, ...

Watch this Scientific Journal Video about Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury at JoVE.com

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskader afholdt fra nefrotoksiner, som omfatter lægemidler, der spænder fra antibiotika til kemoterapeutika, kan resultere i komplekse sygdomme, hvis patogenese forbliver ufuldstændigt forstået. Denne protokol viser, hvordan zebrafisk kan anvendes til sygdom modellering af disse forhold, som kan anvendes til identifikation af renoprotective foranstaltninger.

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

The overall goal of this protocol is to use zebrafish to observe the effect of nephrotoxins such as gentamicin or cisplatin to model acute kidney injury. The main advantage of this technique is that the zebrafish model enables real time imaging of cell damage and regeneration after acute kidney injury. To begin this procedure, prepare an embryo manipulation tool for positioning the embryos for micro injection by attaching a gel loading tip on the end of a five inch straight dissecting needle and secure it with tape or super glue.Next, prepare some fine tapered micro injection needles by pulling the fire polished borosilicate glasses with filament using a pipette puller. Then, use a razor blade or fine forceps edge to cut the needle tips to create sharp angular injection tips. Subsequently, place the needles on a strip of modeling clay in a petri dish to protect the needle tips.To make the micro injection tray, prepare 1.5%agarose E3 soluation in a 100 milliliter Erlenmeyer flask by dissolving the agarose with E3 in the microwave. Then, allow the mixture to cool at room temperature for approximately ten minutes. Pour the cooled agarose E3 solution into a petri dish to make a foundation with a depth of approximately 0.5 centimeters.After it has solidified, pour a second layer of agarose E3 solution. Then, insert the pre-fabricated embryo well mold into the agar, at an angle to avoid any air bubbles, and allow the agarose to solidify at room temperature. After the entire micro injection tray has set, lift the pre-fabricated embryo well mold out slowly and carefully, then fill the dish with E3 solution and store at four degrees celsius.In this procedure, set up the zebrafish mating tanks by placing dividers into the mating chambers and fill with system water. Next, place one fish on each side of the divider, such that each mating chamber contains one female and one male fish, and cover both mating chambers. The next morning, remove the dividers to enable spawning.After approximately 30 minutes, check for any embryos at the bottom of the tank. Then, return the fish to the aquarium and collect their embryos by passing the mating tank water through a fine wire mesh strainer tool. Next, invert the strainer over a petri dish and rinse it with E3 to collect the embryos.Subsequently, incubate the embryos at 28.5 degrees celsius overnight. When the embryos reach 24 to 26 somite stage, decant most of the E3 media. Then, dechorionate them by adding E3 media, then 100 microliters of 50 milligrams per milliliter pronase to each dish of embryos, then incubating the embryos at 28 degrees celsius for 15 minutes.After 15 minutes, fill the dish with E3 and then swirl gently to dislodge the chorions from the embryos. Then, decant the E3 pronase and rinse the dish with 25 milliliters of fresh E3.To block the development of pigmentation, replace E3 with 25 milliliters of fresh E3 PTU 24 hours post fertilization. For experiments spanning several days, replace the E3 PTU solution with fresh media once a day to keep the dish clean.On the day of injection, prepare the desired nephrotoxin solution with the appropriate vehicle control. Vortex or mix it gently. Afterward, check the sides of the tube and top of the water column to ensure the drugs are dissolved in solution.Load a trimmed micro injection needle with two to three microliters of nephrotoxin by threading a fine gel loading tip into the back of the needle, and suspend the needle vertically with a piece of tape to allow the solution to fill the trimmed needle tip by gravity. Once the needle tip is full, secure the loaded needle into the micro manipulator. Test the micro injection volume by placing a drop of mineral oil onto a micrometer slide and inject into the oil to evaluate the droplet size.Next, remove the dish of embryos from the incubator and anesthetize them by adding five milliliters of 0.2%tricaine to the embryo dish. Subsequently, transfer the embryos to the injection mold with a transfer pipette. Maneuver each embryo into a different well of the mold, placing the head in the deepest area of the well such that the trunk rests along the depression and the tail sticks out a bit.Now, insert the filled needle into the micro manipulator and position the needle tip next to an embryo. Gently insert the needle into the tail vein for micro injection. The most critical step of the procedure is the micro injection.To ensure success, the needle must be cut at a sharp angle, it must be moved carefully into position next to the embryo. If the injection is successful you should see the liquid entering the circulation. Co-injection of the nephrotoxicant with fluorescently conjugated dextrin would enable the researcher to verify successful injection after the procedure.Afterward, gently remove the needle from the embryo. Transfer the embryo to a clean dish and rinse to remove the tricaine with fresh E3 PTU. Then, incubate the embryo to the desired time point to assess morphology, which can be documented by photography in methyl cellulose mounting media.Or process for experimental analysis as desired. Note that recovery of embryos should be assessed every 12 to 24 hours after the injection to determine the the percentage of individuals with edema, which commonly indicates renal injury. The transparency of the zebrafish embryo facilitates the micro injection procedure and can be further enhanced by PTU chemical treatment at 24 hpf, to lessen the development of pigmentation during a typical experimental time course.Here, embryo specimens were allowed to develop through the 72 hpf stage then were either mock injected, micro injected with saline vehicle, or micro injected with 2.5 milligrams per milliliter gentamicin. Subsequent live observation was conducted at one and two days post injection using transillumination lighting with a stereo microscope. Compared to mock or saline injected embryos, only the gentamicin injected individuals showed the development of edema.In this case, pericardial edema suggesting an abrogation of normal kidney functionality consistent with previously published observations. Following this procedure, other methods such as whole mount C2 hybridization can be performed in order to access changes in gene expression after nephrotoxin exposure.