Meten

Adenosine-trifosfaat hydrolyserende enzymen, of ATPasen, spelen een cruciale rol in een breed scala van cellulaire functies. Deze dynamische eiwitten kunnen energie op te wekken voor het mechanisch werk, zoals eiwitten mensenhandel en degradatie, transport van opgeloste stoffen, en cellulaire bewegingen. De hier beschreven protocol is een eenvoudige test voor het meten van de in vitro activiteit van gezuiverde ATPasen voor functionele karakterisatie. Eiwitten hydrolyseren ATP in een reactie die resulteert in anorganisch fosfaat afgifte en de hoeveelheid fosfaat vrijgemaakt wordt vervolgens gekwantificeerd onder toepassing van een colorimetrische assay. Deze zeer flexibele protocol kan worden aangepast om ATPase-activiteit te meten in kinetische of eindpunt assays. Een representatief protocol is hier voorzien gebaseerd op de activiteit en vereisten van Epse, de AAA + ATPase betrokken type II Uitscheiding in de bacterie Vibrio cholerae. De hoeveelheid gezuiverde eiwit nodig te meten, lengte van de test en het tijdstip en het aantal sampling intervallen, buffer en zoutsamenstelling, temperatuur, co-factoren, stimulerende middelen (indien aanwezig), etc. kunnen afwijken van de hier beschreven en aldus sommige optimalisering nodig zijn. Dit protocol voorziet in een basiskader voor het karakteriseren ATPasen en kan snel worden uitgevoerd en gemakkelijk als nodig aangepast.