तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विषाक्त पुफेरफिश की बेहतर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन-प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता जीनोटाइपिंग

एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) -restriction टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) तरल क्रोमैटोग्राफी / electrospray आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस) द्वारा विषाक्त पुफेरफिश प्रजातियों जीनोटाइपिंग के लिए विधि के एक उन्नत संस्करण में वर्णित है। डीएनए निष्कर्षण एक सिलिका झिल्ली आधारित डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग किया जाता है। पीसीआर प्रवर्धन एक डिटर्जेंट मुक्त पीसीआर बफर का उपयोग करने के बाद, प्रतिबंध एंजाइमों प्रतिक्रिया समाधान सफ़ाई के बिना समाधान के लिए जोड़ रहे हैं। एक रिवर्स चरण सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ और एक फूरियर उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर एक संशोधित Kingdon जाल विश्लेषक होने स्पेक्ट्रोमीटर, क्रमशः जुदाई और पता लगाने के लिए कार्यरत हैं। मोबाइल चरण, 400 मिमी 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol से मिलकर, 15 मिमी triethylamine (7.9 पीएच) और मेथनॉल, 0.4 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर दिया जाता है। नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस विश्लेषण के लिए समय चक्र स्तंभ का संतुलन सहित 8 मिनट है। Deconvolution सॉफ्टवेयर एक आइसोटोप वितरण मॉडल ओ होनेoligonucleotide च जन स्पेक्ट्रम से इसी monoisotopic द्रव्यमान की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (रेंज 26-79 न्यूक्लियोटाइड) के विश्लेषण के लिए, जन सटीकता था 0.62 ± 0.74 पीपीएम (एन = 280) और उत्कृष्ट सटीकता और परिशुद्धता एक ताला बड़े पैमाने पर मानक के उपयोग के बिना 180 घंटे के लिए निरंतर थे।